蜂毒肽是蜂毒素(melittin，MLT)又叫蜂毒肽，是蜂毒的主要成分，約占蜂毒干重的50%，也是蜂毒中具藥理學(xué)作用和生物學(xué)活性的主要組分。MLT呈強堿性，易溶于水，相對分子質(zhì)量為2 849，具有抗炎藥、降壓、鎮(zhèn)痛、抑制血小板凝集、抗輻射、抗菌、抗HIV、抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及抗腫瘤等多種藥理活性。2013年3月，美國科學(xué)家宣布，可以利用在蜂刺毒素中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物質(zhì)毀滅艾滋病毒，防止艾滋病傳播，但又不傷及周圍正常細胞。
蜂毒是工蜂毒腺分泌出來的一種具有芳香氣味的成分復(fù)雜的混合物，主要含有蛋白質(zhì)多肽類、酶類、生物胺類和其他物質(zhì)。蜂毒中研究較多的是蜂毒溶血性貧血肽，又稱蜂毒肽(melittin)。蜂毒肽占蜂毒干重的50%，是蜂毒中主要功能物質(zhì)。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗輻射，近年來又有對其抗癌作用進行研究的報道。但是其臨床應(yīng)用卻有很多局限，主要原因是現(xiàn)有技術(shù)難以將蜂毒中有致敏反應(yīng)并與蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。
研究歷史
人類社會利用蜂毒的歷史悠久，同時人們對蜂毒和蜂毒肽的研究也在不斷深入。自從1952 年Neuman等人用電泳法分離獲得蜂毒肽以來，關(guān)于蜂毒肽的研究拉開了帷幕，很多研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽對體內(nèi)外多種腫瘤細胞都有殺傷作用。
1972 年，Haberman報道1 μmol/L 的蜂毒肽就能阻止腫瘤細胞增殖但卻不抑制正常細胞的生長與克隆率。
1996 年，Arora通過對正常大鼠肝細胞與大鼠肝癌細胞抗缺氧損傷能力的實驗對比，證實蜂毒肽激活磷脂酶 A2（PLA2）能夠解除肝癌細胞對缺氧的抵抗。Dunn 等將來自于鼠抗人骨髓瘤細胞和淋巴瘤細胞表面特異蛋白的抗體 SCFV 基因同蜂毒肽基因相融合，構(gòu)建了能殺腫瘤細胞的抗毒素基因，大腸桿菌中融合基因并表達，精制的抗毒素顯示了體外殺死腫瘤細胞的效能。
1999 年， Kubo 等通過 5 種細胞毒的測定方法對蜂毒肽與嗜酸性粒細胞的主要堿性蛋白進行比較，結(jié)果證實蜂毒肽能插入 K562 細胞的胞膜中進而形成孔道，引起 ca(clo)2+內(nèi)流，使胞內(nèi) Ca2+濃度升高，細胞裂解，最后導(dǎo)致在 1 h 內(nèi)蜂毒肽對實驗的白血病細胞均具殺傷效果。同年，Shamsher 等研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽可激活磷酸脂酶 D 進而裂解人單核白血病細胞（U937）。
2001年，黃雪強等通過人白血病細胞觀察蜂毒肽促凋亡的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對白血病細胞 5 mg/mL 蜂毒肽作用 4 h 與4μg/mL 蜂毒肽作用24h 都可見典型凋亡特征，進一步實驗發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)細胞凋亡同 bcl-2 基因表達顯著下降相關(guān)。
2003年，劉嶺等通過MTT 法對 SMMC-7721、BEL-7402 和 Hep-3B 三種肝癌細胞系進行研究，考察蜂毒肽抑制腫瘤的量效關(guān)系，結(jié)果顯示：在 8～64 μg/mL 劑量時，蜂毒肽的抑瘤率直線上升，在體外表現(xiàn)顯著的抗瘤效果。據(jù)此推測，可能與在高濃度中華蜜蜂毒肽的自聚集相關(guān)，高濃度下多呈四聚體的狀態(tài)，與單體相比更能與細胞膜有效地結(jié)合，進而形成離子通道，改變胞膜通透性，裂解胞膜，表現(xiàn)出極強的體外殺傷腫瘤的效果。2004年，陳永強等利用不同濃度的蜂毒肽對敏感細胞系 U2OS 進行處理，64 mg/L 時對 U2OS 分別作用12 h 和24 h，其壞死率高達 80 %以上，而 16 mg/L 與 32 mg/L 劑量時對細胞增殖有顯著抑制效果，還能夠誘導(dǎo)細胞凋亡及壞死。Don Rivett 博士領(lǐng)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究小組對蜂毒肽抗癌作用進行了研究，研發(fā)出以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素，對前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌都具很好的療效。
2009年8月11日英國《每日郵報》報道，日前美國華盛頓大學(xué)的科學(xué)家公布一項有意義的研究成果——他們借助納米技術(shù)，開發(fā)出一種在顯微鏡下才能看到的“納米蜜蜂”。“小蜜蜂”能鉆進癌細胞，釋放出殺癌良藥，將癌細胞一個個消滅掉。而小蜜蜂比人的發(fā)絲還要小幾千倍。
“小蜜蜂”背上有一個特殊的包裹，包裹里裝的是令常人聞之色變的蜂毒肽。研究人員稱，蜂毒肽是非常好的殺癌良藥。“小蜜蜂”內(nèi)部還有專門的定位物質(zhì)，能夠指引它一路前行，直達患處。在實驗中，納米蜜蜂屬”已經(jīng)令患有乳腺癌的小白鼠體內(nèi)的癌細胞減少了45%，而患有皮膚癌的小白鼠體內(nèi)的癌細胞則銳減了75%之多。
結(jié)構(gòu)介紹
蜂毒肽是由 26 個殘基組成的多肽，分子量 2 840 , 其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基順序為
NH2- Gly ILE- GLY- ALA- VAL LEU- 百合屬 VAL- LEU- THR- THR- GLY- LEU- PRO- ALA- LEU- ILE- SER-TRP- ILE- LYS- ARG- LYS- ARG- GLN- GLN- COOH。在通常情況下, C- 末端有 4 個氨基酸殘基攜帶正電荷,N- 末端有 2 個氨基酸殘基攜帶正電荷, 整個分子 帶 6 個正電荷。
蜂毒肽的 N- 末端起前 20 個殘基主要是疏水的, C- 末端的 6 個氨基酸殘基主要是親水的。分子的 3 個賴氨酸和 2 個精氨酸殘基使其成為強堿性肽，在中性水溶液中, 蜂毒肽作為單體是以隨機的卷曲結(jié)構(gòu)存在的, 而隨著 pH 值以及離子強度的增高, 蜂毒肽自我交聯(lián), 形成尾旋的四聚體結(jié)構(gòu)，有研究發(fā)現(xiàn)在不同的溶液中華蜜蜂毒肽的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域及螺旋間的角度是不同的。螺旋結(jié)構(gòu)中前 21 個氨基酸是極性的, 位于螺旋的表面, 而非極性氨基酸在螺旋的另一面。這個兩親性(am-phiphilie)是膜結(jié)合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。所以這個特性決定蜂毒肽既可以溶于水中, 又可以與膜自然結(jié)合, 進而溶解細胞。
毒理學(xué)
藥物機理
輔致癌因素抗生素的毒性很小，由于β-內(nèi)胺類作用于細菌的細胞壁，而人類只有細胞膜無細胞壁，故對人類的毒性較小，除能引起嚴重的過敏反應(yīng)外，在一般用量下，其毒性不甚明顯。是化療指數(shù)最大的抗生素。但其青霉烷常見的過敏反應(yīng)在各種藥物中居首位，發(fā)生率最高可達5%～10% ，為皮膚反應(yīng)，表現(xiàn)皮疹、血管性水腫，最嚴重者為過敏性休克，多在注射后數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，癥狀為呼吸困難、發(fā)、血壓下降、昏迷、肢體強直，最后驚厥，搶救不及時可造成死亡。各種給藥途徑或應(yīng)用各種制劑都能引起過敏性休克，但以注射用藥的發(fā)生率最高。過敏反應(yīng)的發(fā)生與藥物劑量大小無關(guān)。對該品高度過敏者，雖極微量亦能引起休克。注入體內(nèi)可致癲癇樣發(fā)作。大劑量長時間注射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒性(如引起抽搐、昏迷等)，停藥或降低劑量可以恢復(fù)。
蜂毒肽是迄今為止人類所知的抗炎藥活性最強的物質(zhì)之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽性細菌的生長繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗對芐青霉素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒肽還能增強磺胺類和青霉素類藥物的抗菌效力，對多種真菌、病毒也具有毒性。它具有類激素樣的作用，但無激素的不良反應(yīng)。蜂毒肽的鎮(zhèn)痛作用也十分顯著，其對前列腺素合成酶的抑制作用是吲鎂辛的70倍，鎮(zhèn)痛強度為Morphine的40%，鎮(zhèn)痛持續(xù)時間較長。實驗研究證明，全蜂毒、蜂毒肽、神經(jīng)毒素多肽、MCD均能刺激垂體腎上腺系統(tǒng)使皮質(zhì)激素釋放增加而產(chǎn)生抗炎藥作用。蜂毒肽還能抑制白細胞轉(zhuǎn)移，從而抑制了局部的炎癥反應(yīng)。
蜂毒肽可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，其對N-膽堿受體有選擇性阻滯作用，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮傳導(dǎo)阻滯，并表現(xiàn)出中樞性尼古丁型膽堿受體阻滯作用；蜂毒肽還能抑制周圍神經(jīng)沖動傳導(dǎo)。
用蜂毒肽代替蜂毒全毒不僅對輻射有預(yù)防作用，而且還有治療作用。高純度的蜂毒肽可以明顯提高抗輻射效應(yīng)，而且和全蜂毒比較差別非常明顯。蜂毒肽對腫瘤細胞的毒性作用也引起了人們的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接對細胞的磷脂膜起溶解作用，抑制細胞發(fā)育，對腫瘤細胞有強烈的細胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易產(chǎn)生過敏反應(yīng)；因其是破壞細胞膜而導(dǎo)致細胞的死亡，因此它不用進入細胞，在細胞外即可顯示出其破壞腫瘤細胞毒性。澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRo)DE Riven博士領(lǐng)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究小組正在對蜂毒肽的抗癌作用進行研究，他們制造的以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素也可對前列腺癌、膀胱移行細胞癌、乳腺癌產(chǎn)生療效。《中國醫(yī)藥報》也曾報道，蜂毒素可抑制肝癌細胞的生長、增殖，并且減少增殖細胞中和抗原附性細胞的表達，影響細胞周期的比率，為蜂毒素臨床應(yīng)用于抗腫瘤提供了實驗依據(jù)。
生物機制
至今為止，對于蜂毒素的殺菌及溶血性貧血機理仍然很不確定，以往研究認為，抗細菌素類是通過穿孔模型形成膜空洞機制引起殺菌的。但深入研究發(fā)現(xiàn)，有些抗細菌素與細胞膜的作用方式與穿孔模型有明顯不同，后來便提出了一種新的作用模式--地毯模式。
目前，抗細菌素侵膜機理占主導(dǎo)地位的觀點仍然是穿孔模型和地毯模式機理。根據(jù)蜂毒素的這種侵膜機制，趙亞華等通過實驗有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一級結(jié)構(gòu)序列以及所要表達的蜂毒素基因。盡量使蜂毒素在與細菌細腦膜相互作用時，主要采取地毯模式侵膜而引起殺菌，同時，由于帶電荷數(shù)與分子構(gòu)象的改變，大大降低了它與血細胞膜兩親性作用的幾率，從而達到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性貧血性與標準樣品的溶血活性相比，有較大幅度降低，大約降低了14.3倍。
蜂毒肽發(fā)揮其眾多功能的主要機理是因為蜂毒肽可以使細腦膜的透性增加，細胞內(nèi)容物泄露，細胞裂解所以蜂毒肽與天然或是模型膜的作用成為蜂毒肽研究的熱點。Benachir等利用鈣黃綠素作為熒光標記物，系統(tǒng)研究了蜂毒肽誘導(dǎo)的膜滲漏。他們認為蜂毒肽與囊泡的結(jié)合會非常迅速，因為在蜂毒肽作用幾分鐘之后，內(nèi)容物的流出達到最大值，并且停止；而且蜂毒肽誘導(dǎo)的磷脂雙分子層的裂解的發(fā)生機制是“全或無”，也就是說蜂毒肽作用下，有的囊泡的內(nèi)容物全部釋放，而有的則保持完整，沒有滲漏，這與Schwarz 等觀察的一致。內(nèi)容物釋放的比例與蜂毒肽/脂質(zhì)的摩爾比率有關(guān)，只有達到一定量的蜂毒肽才可能有內(nèi)容物滲出。更為特別的是蜂毒肽可以區(qū)別出完整的和已經(jīng)有物質(zhì)滲出的囊泡，說明這兩類脂質(zhì)雙分子層的性質(zhì)有很大的不同。最近有很多報道認為，微粒表面的負電荷可以抑制蜂毒肽對細胞的裂解作用，Benachir等的工作表明卵磷脂雙分子層表面負電荷的存在對蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且與負電荷的密度成一定比例。這可能是由于靜電作用吸附蜂毒肽，而不能更加深入破壞囊泡而形成滲漏。
蜂毒肽可以作用多種酶及細胞蛋白，在裂解的細胞中華蜜蜂毒肽能結(jié)合或改變幾種蛋白質(zhì)功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C；與鈣調(diào)蛋白(calmodulin)具有高度親極性。Fukushi-ma實驗中觀察到蜂毒肽抑制小鼠大腦皮質(zhì)的突觸膜上依賴鳥苷酸的腺苷酸環(huán)化酶活性；還發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能明顯刺激Gil和Gll活性，但卻抑制Gs活性。動力學(xué)研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因為抑制GDP的釋放，從而增加了鳥酸造成的。而激活Gi與抑制Gs很可能與抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性有關(guān)。細胞脂酶的活性產(chǎn)物包括肌醇三磷酸(IP3)、甘油二(DG)和脂肪酸(FA)等是細胞生理活動重要的第二信使系統(tǒng)，而有實驗表明蜂毒肽可以激活細胞脂酶，包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及三酸甘油脂酶等。磷酸甘油酯和甘油三酯是細胞內(nèi)主要的酰化酯(包含脂肪酸)。而甘油三酯的相對含量可占細胞總脂量的5%～60%。
應(yīng)用
基因工程
生物工程技術(shù)的發(fā)展為獲得蜂毒肽提供了一條新的途徑，Kindas等從處女蜂王的毒腺中提取得到了總mRNA，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽mRNA含大約400個核苷酸堿基對和1個短的poly A尾。Vlasak等用mRNA-脫氧核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄的方法，利用質(zhì)粒pBR322構(gòu)建了蜂王毒腺的cDNA文庫，用蜂王毒腺總mRNA制作探針從此文庫中分離得到了蜂毒肽的cDNA，再進一步將其克隆到質(zhì)粒pUC18上進行DNA序列分析，由DNA的序列分析結(jié)果推測出的蜂毒肽序列與實際測得的完全相同。張青文從1991年開始提取了蜂王毒腺的核糖核酸，用于棉鈴蟲卵中的轉(zhuǎn)譯，成功地合成了Promelittin，并對提取的mRNA成分進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總RNA在除去rRNA后就可得到高純度的蜂毒肽mRNA。李繼周等于1997年通過mRNA-cDNA反轉(zhuǎn)錄的方法合成了蜂毒肽基因，用lgtll 建立了蜂毒肽的cDNA文庫，并用抗體探針篩選出了附性克隆。陳仲兵等進一步將蜂毒肽cDNA克隆到大腸桿菌質(zhì)粒Pucl8上，并進行了序列分析。王關(guān)林等從蜜蜂屬毒腺中提取總核糖核酸，通過RT-PCR方法擴增得到了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，再進一步通過定點誘變在蜂毒肽序列前引入了經(jīng)胺裂解位點，構(gòu)建了與β-半乳糖昔酶部分序列相融合的蜂毒肽誘變蛋白表達載體，序列分析結(jié)果表明，成功地引入了目的密碼子，且與β-半乳糖苷酶部分序列構(gòu)成正確的讀碼框，并在大腸桿菌中表達了誘變蛋白。王關(guān)林克隆了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，并在大腸桿菌中表達了與β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前體蛋白。王秋波等報道通過人工合成含特異性酶切位點的AB兩條寡核苦酸片段，在Klenow 酶作用下形成目的基因，用限制型內(nèi)切酶Hind Ⅲ，Xmn Ⅰ同時酶切目的基因和表達載體Pmalp2質(zhì)粒，在T4連接酶的作用下構(gòu)建兩者的重組體，通過α-互補篩選出附性克隆，并通過特異性酶切和測序分析進行鑒定，獲得重組蜂毒肽的原核生物表達克隆。
蜂毒肽的溶血性貧血作用限制了它的臨床應(yīng)用。為克服其溶血毒副作用，人們嘗試通過改變蜂毒素分子構(gòu)像，將蜂毒素分子與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)成免疫毒素或制成緩釋劑等方法來減輕其不良反應(yīng)，增強抗腫瘤活性的目的。
趙亞華等為獲得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素，對蜂毒素的分子結(jié)構(gòu)進行了改造。將第5位的Val變?yōu)锳rg，第15位Ala變?yōu)锳rg，刪除了第16位的Leu。用PCR技術(shù)獲得了改造后的蜂毒素基因，將其克隆人酵母表達載體pPICZa-A，獲得重組表達質(zhì)粒PPICZa-A-MEA。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115，甲醇誘導(dǎo)下表達，發(fā)酵上清液經(jīng)抑菌活性、溶血性貧血活性測定及親和層析純化，結(jié)果表明，蜂毒素基因成功地在畢赤酵母中表達，經(jīng)改造后表達的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性顯著降低，經(jīng)純化后用Bradford法測定表達蜂毒素的含量約為0.29 mg/mL。
李柏、張晨等應(yīng)用基因工程，構(gòu)建攜蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)啟動子(rAFP)的重組腺病毒載體，探討rAFP驅(qū)動的蜂毒素基因在體外對肝癌細胞的特異性殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攜蜂毒素基因重組腺病毒科載體構(gòu)建成功，MTr實驗證明攜蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，AFP附性肝癌細胞的增殖受到明顯抑制，而對AFP陰性肝癌細胞及正常肝細胞無明顯影響；無蜂毒素基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染，則對各種細胞增殖均無抑制作用，他們等還發(fā)現(xiàn)蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL-7402細胞后，肝癌細胞周期受到不同程度的影響，Go/G期細胞增多，細胞增殖核抗原(PCNA)標記指數(shù)較對照組明顯下降，提示癌細胞較多被阻滯于G期，蜂毒素基因在癌細胞內(nèi)的表達干擾了其細胞周期，抑制了癌細胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是其作用機制之一。細胞增殖與凋亡的失衡決定了腫瘤的生長速率。凋亡不僅直接影響著機體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，它在腫瘤治療中的作用已受到極大的重視。研究證明，蜂毒素具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。經(jīng)攜蜂毒素基因重組腺病毒科轉(zhuǎn)染后，倒置相差顯微鏡下觀察到部分肝癌細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化，體積變小、變圓，染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象。攜蜂毒素基因重組腺病毒可有效誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，凋亡率在20%左右，高于不舍蜂毒素基因重組腺病毒和未轉(zhuǎn)染重組腺病毒對照組，提示誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡亦是蜂毒素基因治療發(fā)揮作用的機制之一。
遏制艾滋
美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn)，蜂刺中的物質(zhì)蜂毒肽可以刺穿艾滋病毒的保護外層，毀滅艾滋病毒。科學(xué)家們把這種毒素注入納米粒中，上面配有特制的“緩沖器”，使之能夠彈 離正常細胞，從而避免傷及正常細胞。當(dāng)較小的艾滋病毒與它們接觸時，會從緩沖器之間滑過，遭到毒素攻擊。此前，大多數(shù)藥物只能減緩艾滋病毒的生長，而最新研究出的這種蜂毒能夠攻擊并殺死病毒，第一時間防止感染。
合作撰寫研究報告的醫(yī)學(xué)院專家約書亞·胡德介紹說，這種毒素可以用于制作防止艾滋病傳播的凝膠。“我們希望，在艾滋病迅速傳播的地區(qū)，人們能夠利用這種凝膠作為阻止其初期感染的預(yù)防措施。我們破壞的是艾滋病毒的物理性能。從理論上說，艾滋病毒沒有任何辦法適應(yīng)蜂毒的攻擊。”
該研究報告發(fā)表在《抗病毒療法》雜志上。科學(xué)家們認為，它有可能是開發(fā)遏制艾滋病毒猖傳播藥劑的重要步驟。醫(yī)生們還認為，可以進一步開發(fā)納米粒子，嘗試殺死腫瘤細胞。
參考資料 >