轉(zhuǎn)基因動物是指將特定的外源基因?qū)珓游?a href="/hebeideji/7299003420114927654.html">受精卵或胚胎。使之穩(wěn)定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。
概念
遺傳的基本物質(zhì)是脫氧核糖核酸，基因則是位于染色體上有遺傳效應(yīng)的DNA片段，對于儲存在生物全套染色體中的全部遺傳信息，可稱其為基因組。由于不同種類、不同個(gè)體的生物基因組成是不同的，因此對動物個(gè)體來說，非自身的基因成分屬于外源基因，如果把外源基因整合或?qū)雱游锶旧w基因中，那么這個(gè)外源基因就被稱為轉(zhuǎn)基因(transgene)(即轉(zhuǎn)移來的基因)，這種動物就是轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animals)。
轉(zhuǎn)基因動物所有的細(xì)胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物，這類動物只有在整合了外源基因的“部分組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時(shí)，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。
基因轉(zhuǎn)移方法
哺乳綱基因轉(zhuǎn)移方法，是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動物的受精卵(或著床前的胚胎細(xì)胞)，然后將此受精卵(或著床前的胚胎細(xì)胞)再植入受體動物的輸卵管(或子宮)中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。
根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯ο蟮牟煌壳爸谱鬓D(zhuǎn)基因動物的方法主要有顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)法、電脈沖法、精子載體導(dǎo)入法等。
顯微注射法
是最常用且成功率較高的方法，以轉(zhuǎn)基因小鼠的制作為例，大致過程如下。
一、采集受精卵
（1）超排卵：選取6～8周齡的雌性小鼠，先后腹腔注射5U孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonactotropin，PMSG)和2.5～5.0U人絨毛膜促性腺激素(humar chorionic gonactotropin，尿促卵泡素)，以促進(jìn)排卵，然后與鼠齡為12周～l年的雄性小鼠按1:1交配。交配成功的標(biāo)志是在雌性小鼠的陰道口發(fā)現(xiàn)白色的陰道栓。
（2）取受精卵：與雄性小鼠合籠的次日上午，將確認(rèn)有陰道栓的雌性小鼠用頸椎脫臼法剖殺，取出輸卵管，置于培養(yǎng)液中，在體視顯微鏡下小心的切開輸卵管膨大的壺腹部，用透明質(zhì)酸酶溶液稍用力沖洗，使受精卵與輸卵管分離，并流到培養(yǎng)液中，在體視顯微鏡下選擇原核生物清晰的受精卵，移人裝有培養(yǎng)液的胚胎培養(yǎng)皿中，然后在培養(yǎng)皿滴加礦物油使之覆蓋在培養(yǎng)液表面，在CO2孵箱(37℃，5％CO2，95％空氣)中培養(yǎng)5h左右(一般在上午10時(shí)左右取受精卵，培養(yǎng)至l3時(shí)可見雌、雄性原核，多數(shù)受精卵通常在13～18時(shí)之間原核形成并清晰可見)。
二、向受精卵雄性原核注入脫氧核糖核酸溶液
受精卵中，有分別來自卵子和精子的兩個(gè)原核，通常來自精子的雄性原核較大，能容納更多的外源DNA，因此一般都是向雄性原核注入DNA溶液。另外，要導(dǎo)入的基因DNA還必須先用瓊脂糖凝膠電泳法測定其純度。將含有10～20個(gè)受精卵的培養(yǎng)液滴和DNA液滴共同滴放于載玻片上，然后固定在顯微注射儀的載物臺上，將視野中央調(diào)于DNA液滴上，右手持充滿礦物油的玻璃吸管吸取DNA溶液，吸入量以DNA溶液和礦物油之問出現(xiàn)彎月形位置為準(zhǔn)，然后再將視野中央移至
受精卵液滴上，左手控制持卵吸管，利用負(fù)壓將受精卵固定，并將右手的吸管尖端移至固定了的受精卵上，繼而插入受精卵雄性原核生物，將脫氧核糖核酸溶液注人雄性原核中，為肯定是否已注入，須用肉眼確定雄性原核是否膨大。僅將未損壞的完成操作的卵收集起來，在37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，第2天將發(fā)育成2細(xì)胞的卵挑選出來。
用結(jié)扎了輸精管的雄性小鼠與發(fā)情期的雌性小鼠(一般選用ICR小鼠)進(jìn)行交配，雖然不能引起受精，但可以刺激子宮頸管，使雌性小鼠體內(nèi)的黃體活化，造成能繼續(xù)妊娠的內(nèi)分泌環(huán)境，這種小鼠稱為假孕雌性小鼠。將經(jīng)顯微注射的2細(xì)胞受精卵移植至交配第3天的假孕母鼠輸卵管中，仍可正常發(fā)育。操作時(shí)，最好是在兩側(cè)輸卵管各移植l2個(gè)卵，這樣，情況良好時(shí)可得8只仔鼠，有時(shí)僅能產(chǎn)生1只仔鼠，因?yàn)?a href="/hebeideji/7222994910638391311.html">脫氧核糖核酸注入而造成的損傷可使許多受精卵在中途停止發(fā)育。
四、導(dǎo)入基因的鑒定
通常，胚胎移植生育出的全部仔鼠中，約有20％～30％具有導(dǎo)入基因，因此要用Southern Blot或PCR法對導(dǎo)入的遺傳基因進(jìn)行分析，以便挑選制作外源性基因?qū)氤晒Φ?a href="/hebeideji/1420974155269378153.html">小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖。
基因顯微注射法的特點(diǎn)是外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長度可達(dá)lOOkb(10萬個(gè)堿基對)。它可直接獲得純系，所以實(shí)驗(yàn)周期短。但需要貴重精密儀器，技術(shù)操作難度大，并且外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù)都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變，重則致死。
五、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法
反轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞染色體脫氧核糖核酸的能力。將外源基因DNA插入反轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過輔助細(xì)胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細(xì)胞導(dǎo)入子宮，可發(fā)育成攜帶外源基因的子代動物。
該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點(diǎn)整合，適合于難以觀察到原核生物的鳥綱受精卵。由于病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩(wěn)定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達(dá)。
胚胎干細(xì)胞法
胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是指從囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的尚未分化的胚胎細(xì)胞，具有發(fā)育全能性，能進(jìn)行體外培養(yǎng)<擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化和制作遺傳突變型等遺傳操作。本法以整合有外源基因的ES細(xì)胞作為供體細(xì)胞，大致過程如下：
(1)獲取發(fā)育至一定時(shí)期的胚胎，經(jīng)培養(yǎng)后，剝離和分散內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，再培養(yǎng)，最后分離、擴(kuò)散、鑒定ES細(xì)胞。
(2)通過基因打靶技術(shù)，將外源基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、電脈沖法等方法導(dǎo)入ES細(xì)胞，體外培養(yǎng)和篩選有外源基因表達(dá)者。
(4)通過顯微操作將ES細(xì)胞注入到囊胚期胚胎的腔內(nèi)，使之與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)緊靠在一起，成為嵌合體。
(5)將注射過的胚胎，經(jīng)培養(yǎng)后篩選無發(fā)育缺損的囊胚，移植到交配第3天的假孕受體動物子宮內(nèi)，培育出轉(zhuǎn)基因動物。本法外源基因整合率高，植入囊胚前篩選合適的轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞，克服了以前只能在子代選擇的缺點(diǎn)，并能充分利用分子生物學(xué)發(fā)展起來的各種先進(jìn)方法，是很有前途的技術(shù)。缺點(diǎn)是不易建立ES細(xì)胞系。并且由于通過嵌合體途徑，所以實(shí)驗(yàn)周期長。
電脈沖法
電脈沖法(electroporation)又稱電穿孔法，是將供體脫氧核糖核酸與受體細(xì)胞充分混勻，在外界的高電壓短脈沖下改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，運(yùn)送到細(xì)胞核。1980年，津墨緬(Zimmermann)等首先應(yīng)用電脈沖技術(shù)把藥物及染料導(dǎo)人小鼠胸腺細(xì)胞及紅細(xì)胞，同年汪大鍵(T.K.Wang)和細(xì)基(Neumail)首先報(bào)道了用電脈沖法將TK基因?qū)薈TK小鼠的CTK細(xì)胞，在106個(gè)處理細(xì)胞中得到了67個(gè)轉(zhuǎn)化克隆：開創(chuàng)了外源基因的電脈沖方法。目前在動物中電脈沖法主要用來轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞。
精子導(dǎo)入法
利用精子作為外源基因載體，借助受精作用把外源因?qū)?a href="/hebeideji/7299003420114927654.html">受精卵，整合到受精卵的基因組中，稱之為精子載體導(dǎo)入法，是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的一種新嘗試。該法簡單、方便，依靠生理受帶過程，免去了對原核生物的損傷。但在實(shí)踐中成功率較低，對精子是否可作為外源脫氧核糖核酸的載體也存在爭論。目前這_技術(shù)尚處在探索階段。該法可以將人工授精、體外受精與轉(zhuǎn)
應(yīng)用
理論研究
一、發(fā)育生物學(xué)的研究
轉(zhuǎn)基因動物可用于觀察目的基因在胚胎不同發(fā)育階段的特異性表達(dá)、關(guān)閉及調(diào)控機(jī)制，了解調(diào)控順序(如增強(qiáng)子、啟動子)在組織特異性表達(dá)中的作用，例如人腎素基因在小鼠體內(nèi)的特異性表達(dá)可能與該基因的5’端側(cè)翼順序有關(guān)。此外，轉(zhuǎn)基因動物還可用于識別動物發(fā)育過程中的基因(包括內(nèi)源基因)及其活動，也可測出與動物發(fā)育相關(guān)的未知基因的表達(dá)特性。
二、遺傳學(xué)研究
利用自然突變或人為修飾的基因作為外源基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物，研究導(dǎo)人的異常基因的表型效應(yīng)，可以了解基因站構(gòu)和功能的蓋系，還可用于基因組印跡分析、遺傳缺陷的矯正等。
醫(yī)學(xué)研究
一、心血管疾病的研究
各種調(diào)節(jié)心血管功能的因子如轉(zhuǎn)脂蛋白、轉(zhuǎn)纖維蛋白溶酶原等都可通過轉(zhuǎn)基因動物來了解其生理功能及作用，建立如動脈粥樣硬化、突發(fā)性高血壓、靜脈閉塞等轉(zhuǎn)基因動物模型。
二、腫瘤學(xué)研究
腫瘤基因的發(fā)現(xiàn)是近10年來腫瘤學(xué)研究的重大突破，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺癌基因等100多個(gè)腫瘤基因。實(shí)驗(yàn)證明，各種脊椎動物都攜帶腫瘤基因，在通常情況下并不引起細(xì)胞癌變，只有在某些條件下才能被激活使癌細(xì)胞增生而導(dǎo)致癌變。建立帶有腫瘤基因的轉(zhuǎn)基因動物可了解哪些組織對腫瘤基因轉(zhuǎn)化活性敏感、腫瘤形成與其基因的關(guān)系、腫瘤基因生長分化影響等等。
三、遺傳病研究
通常是將功能正常的外源基因?qū)雱游矬w的靶細(xì)胞內(nèi)，用來彌補(bǔ)缺陷的基因，改變患病細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，進(jìn)行基因治療。相反的將顯性疾病基因或一個(gè)、甚至多個(gè)外源基因人為地導(dǎo)入動物體內(nèi)，就可制備遺傳性疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，研究和治療人類遺傳性疾病。例如亨廷頓(Hungtington)將舞蹈病基因?qū)?a href="/hebeideji/1420974155269378153.html">小鼠，建立了舞蹈病動物模型，雷德黑得(redhead)將正常小鼠的MBP(髓磷脂堿性蛋白)基因?qū)胝痤澬∈螅∈蟮恼痤澃Y狀消失。
四、免疫學(xué)研究
巴賓耐特(Babinet)發(fā)現(xiàn)雖然轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生HBsAg，但在6個(gè)月內(nèi)沒有任何病理變化，表現(xiàn)為一種持續(xù)的帶病毒狀態(tài)。這些結(jié)果表明：乙型肝炎患者的肝細(xì)胞損傷不是由HBV的HBsAg表達(dá)直接引起，而是通過對肝細(xì)胞膜上的病毒抗原發(fā)生免疫反應(yīng)造成的。因此，可以用轉(zhuǎn)基因小鼠模型來研究免疫耐受與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系以探討發(fā)病機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠還為研究第l和第Ⅱ類主要組織相容性抗原的功能提供了新手段。
改良和培育新品種
經(jīng)典的遺傳育種方法要在同種或親源關(guān)系很近的種間才能進(jìn)行，并且受到變異或突變的限制，而使用重組脫氧核糖核酸技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)就可使親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的種間遺傳信息進(jìn)行交換和重組。另外由于轉(zhuǎn)基因動物可以穩(wěn)定地整合外源基因，并在合適的組織表達(dá)，還能將這種性狀遺傳給后代，這樣就可以生產(chǎn)出生長快、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)奶更多而耗料極少的轉(zhuǎn)基因家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。
研制生產(chǎn)活性物質(zhì)
將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)思倚蠡蚣仪莸?a href="/hebeideji/7299003420114927654.html">受精卵，在發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動物體液或血液、乳、尿、腹水中收獲基因產(chǎn)物，便可獲得大量有價(jià)值的生物活性蛋白，通常將此動物稱為“動物生物反應(yīng)器”。其中以乳汁為最理想的分泌部位。目前，tPA(組織型纖溶蛋白元激活因子)已在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中得到了表達(dá)，成為治療血栓的理想藥物。β-乳球蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中可表現(xiàn)出羊奶的主要成分——β-α-乳糖球蛋白。此外，凝血因子Ⅳ和α1-抗胰蛋白酶也在轉(zhuǎn)基因綿羊中得到了表達(dá)。其他如乙型肝炎病毒抗原、卵泡刺激素、促黃體生成素等也都能按需要利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)，為醫(yī)藥、食品及畜牧業(yè)的發(fā)展開辟了極為廣闊的天地。
疾病基因模型
疾病動物模型
疾病動物模型對醫(yī)學(xué)的發(fā)展作出了貢獻(xiàn)。但是，許多疾病難以用人工誘發(fā)的方法制造動物模型，或許多疾病在實(shí)驗(yàn)動物身上不發(fā)生或僅僅是高等哺乳綱才發(fā)生，因此難以通過自發(fā)或人工定向培育的方法獲得動物模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，為人類精確地研究基因與疾病的相關(guān)關(guān)系提供了可能，而且可以在個(gè)體發(fā)生的每個(gè)階段中使用任何個(gè)體進(jìn)行遺傳功能的分析。因此，轉(zhuǎn)基因疾病動物模型的開發(fā)成為轉(zhuǎn)基因動物的熱點(diǎn)，有的已進(jìn)入應(yīng)用階段。
一、病毒性疾病模型
（1）小兒麻痹病毒受體轉(zhuǎn)基因小鼠：把人的小兒麻痹病毒受體克隆并制作轉(zhuǎn)基因小鼠。將小兒麻痹病毒的細(xì)胞性受體基因(human PVR gene)顯微注射至C57BL／10小鼠的早期胚胎中，制作轉(zhuǎn)基因小鼠并育成品系。這種小鼠表達(dá)人源的受體，有小兒麻痹病毒的感受性。而且感染了這種病毒的小鼠表現(xiàn)出和人一樣的臨床癥狀，對病毒株的特異性也表現(xiàn)出與人相同的性質(zhì)。因此，這種小鼠除了是人的疾病模型之外，同時(shí)還可能替代猴子進(jìn)行小兒麻痹病毒的效果、特異性等的檢定，具有廣泛的用途。
（2）乙型肝炎病毒攜帶者模型：乙型肝炎病毒(肝炎 B 病毒，HBV)攜帶者的肝癌發(fā)生率為正常人的100~200倍，但尚缺乏有效的治療方法。HBV只感染人或大猩猩屬，尚未研究出其他適宜的動物模型。通常認(rèn)為，對HBV的免疫應(yīng)答是受基因支配的，其免疫應(yīng)答不充分者則成為慢性肝炎；肝癌的發(fā)生機(jī)制并不是單一的，由慢性肝炎的存在引起的肝細(xì)胞壞死和再生之問存在種種的遺傳變異并出現(xiàn)癌變。HBV基因組是含有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈脫氧核糖核酸分子，兩條單鏈長度不一，長鏈為負(fù)鏈(3.2kb)，短鏈為正鏈，約為負(fù)鏈的50％～80％。因此，如果使l．2HB-BS的DNA成為兩端重復(fù)的線狀DNA用于轉(zhuǎn)導(dǎo)，可實(shí)現(xiàn)全基因組的表達(dá)。另一方面，當(dāng)僅要求HBS抗原表達(dá)時(shí)，僅需要導(dǎo)入1.2HB-BS基因即可。將添加了l.2HB-BS的HBV DNA導(dǎo)人C57BL／6J小鼠，在肝復(fù)制HBV，在血中釋放病毒粒子。基因的表達(dá)在胚胎期發(fā)生，但對這些病毒抗原表現(xiàn)免疫寬容(鈍化狀態(tài))，不表現(xiàn)任何病理學(xué)變化，因此可作為人HBV攜帶者的模型。導(dǎo)人基因的小鼠與人一樣，臨床表現(xiàn)沒有任何異常。
（3）乙型肝炎表面抗原轉(zhuǎn)基因動物模型：將人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因?qū)胄∈螅色@得轉(zhuǎn)HBsAg基因小鼠，而且該轉(zhuǎn)基因小鼠的肝中可以產(chǎn)生HBsAg。這種轉(zhuǎn)基因小鼠既可以模擬患者的帶毒狀態(tài)又不導(dǎo)致發(fā)病。奇薩利(Chisari)發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠用HBsAg加上福氏完全或不完全佐劑免疫，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，而HBsAg陰性的轉(zhuǎn)基因小鼠則有應(yīng)答反應(yīng)，HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠在6個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)任何病理改變，卻表現(xiàn)為持續(xù)的帶毒狀態(tài)。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，乙型肝炎患者的肝細(xì)胞損傷不是由HBsAg表達(dá)直接引起的，而是通過對肝細(xì)胞膜上的病毒抗原發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)造成的。這種轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用來研究免疫應(yīng)答耐受與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系，探討發(fā)病機(jī)制、持續(xù)帶毒狀態(tài)及其清除、藥物篩選實(shí)驗(yàn)、HBV 脫氧核糖核酸在宿主內(nèi)的復(fù)制、表達(dá)及調(diào)控與乙型肝炎發(fā)病的關(guān)系等有關(guān)HBV病理學(xué)和治療學(xué)方面的難題。
除上述轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的建立之外，尚有一些其他病毒性疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型也得以建立。如注射JC病毒基因組獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以用作多發(fā)性白質(zhì)腦病(progressive multifocal leukoencephalopathy，PML)的轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型，利用人T淋巴細(xì)胞l型病毒(HTLV-1)的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)基因制備的轉(zhuǎn)基因小鼠，可作為人神經(jīng)纖維的疾病動物模型等。
二、腫瘤轉(zhuǎn)基因動物模型
哺乳綱的脫氧核糖核酸攜有癌基因(oncogene)，在物理化學(xué)或生物因子作用下被激活，引起細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控失常以及與周圍組織關(guān)系的紊亂，從而導(dǎo)致癌變。用癌基因或致癌病毒基因制作腫瘤轉(zhuǎn)基因動物模型，可以探討外來癌基因與實(shí)驗(yàn)動物的原癌基因(susceplible protooncogene)、癌基因表達(dá)與癌轉(zhuǎn)化、癌基因表達(dá)與動物遺傳背景或外界激活因素的關(guān)系。
通過向小鼠受精卵插入癌基因或原癌基因培育轉(zhuǎn)基因小鼠，可在整體水平上研究癌基因?qū)?a href="/hebeideji/7182145673905618956.html">細(xì)胞正常分裂分化的影響，從而可以準(zhǔn)確地研究癌基因與腫瘤形成的關(guān)系。例如，SV40T抗原基因是一個(gè)在轉(zhuǎn)基因小鼠中得到廣泛研究的轉(zhuǎn)化基因。布林斯特(Brinster)等(1984)將T抗原序列與其自身的增強(qiáng)一啟動子序列相連后導(dǎo)入小鼠，發(fā)現(xiàn)外源基因可在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)先表達(dá)并引起脈絡(luò)叢乳頭狀瘤。將T抗原序列與不同的啟動子序列連接后的重組分子，導(dǎo)入小鼠后也能在啟動子序列表達(dá)的組織引起腫瘤。這些組織分別是胰、肝、眼晶狀體，甚至心肌組織等。
另外，像病毒癌基因、細(xì)胞原癌基因與不同啟動子連接后，也被導(dǎo)入小鼠并獲得轉(zhuǎn)基因動物。如將C-myc癌基因置于小鼠乳腺腫瘤病毒(mMTV)基因啟動子的調(diào)節(jié)下，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠在胸部、睪丸和淋巴組織等部位都可引起腫瘤。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，原癌基因的異常調(diào)節(jié)有使組織易于惡化的傾向。
上述轉(zhuǎn)SV40T抗原基因和c-myc基因小鼠的研究結(jié)果有力地支持了腫瘤多步發(fā)生的假說，即腫瘤的發(fā)生至少需要二次轉(zhuǎn)化。如轉(zhuǎn)T抗原和c—myc基因在各個(gè)器官都得以表達(dá)，但只在少數(shù)幾個(gè)器官發(fā)生癌變。
三、代謝性疾病轉(zhuǎn)基因動物模型
（1）高歇(Gaucher)病轉(zhuǎn)基因動物模型
Gaucher病是葡萄糖酶缺損(溶酶體酶的一種)引起內(nèi)臟葡萄糖腦苷脂積蓄的代謝病。依臨床癥狀可分為3種類型，其中，成人型(1型)和亞急性青年型(Ⅲ型)發(fā)生肝脾腫大或貧血、骨質(zhì)疏松癥，急性嬰兒型(Ⅱ型)則表現(xiàn)肌肉痙攣等中樞神經(jīng)癥狀。各型的肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等出現(xiàn)Gaueher細(xì)胞(含有葡萄糖腦苷脂的巨噬細(xì)胞)。已報(bào)道了自發(fā)裸鼠和實(shí)驗(yàn)誘發(fā)模型，但在治療等方面的研究還不充分。
改造小鼠的β-葡萄糖苷酶基因，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行基因打靶。在外顯子9和外顯子10之間構(gòu)筑具新青霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因(neor)或在3’端構(gòu)筑具有HSV-tk的靶載體(targeting vector)，在ES細(xì)胞中實(shí)施PNS(正負(fù)選擇法)選擇。其后，對嵌合小鼠進(jìn)行品系化培育，分析純合子或雜合子。與正常個(gè)體的β-烷基糖苷酶活性相比，雜合子為44％，純合子為4％。純合子中表現(xiàn)了p葡萄糖腦苷脂的積蓄。純合子個(gè)體大小正常或比雜合子明顯小，呈現(xiàn)呼吸困難、發(fā)。這樣的個(gè)體不被母鼠飼養(yǎng)，全部都在24h內(nèi)死亡。病理顯示肝、骨髓、腦、脾的巨噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)脂肪積累，和人的病理改變相同，只是這種小鼠的肝，在胎兒早期可以見到血細(xì)胞的分化圖像，雖然巨噬細(xì)胞溶酶體中有脂肪積蓄，但是急死的情況并不多見。可以認(rèn)為，與Gaucher病Ⅱ型的小兒患者所見的急性神經(jīng)癥狀是一致的。
該模型是現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因疾病動物模型中評價(jià)最高且已得到應(yīng)用的基因模型之一。
（2）FAP轉(zhuǎn)基因小鼠
家族性神經(jīng)多發(fā)性淀粉樣變(familial amyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP)是常染色體顯性遺傳的疾病，發(fā)生全身的細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉著，是以末梢神經(jīng)和自主神經(jīng)損害為主的疾病。淀粉樣蛋白的主要成分發(fā)生變異，患者大部分是第30位氨酸置換為甲硫氨酸，已證明是變異氨基酸所對應(yīng)基因的堿基出現(xiàn)置換。因此，從病因上講，它是蛋白質(zhì)變異直接導(dǎo)致淀粉樣蛋白沉著的疾病。構(gòu)建帶有金屬硫蛋白基因MT啟動子的變異淀粉樣蛋白基因并用轉(zhuǎn)基因方法整合到C57BL／6J小鼠，對該轉(zhuǎn)基因小鼠的分析結(jié)果表明，變異淀粉樣蛋白基因表達(dá)從胚胎期就可見到，而變異淀粉樣蛋白沉著則發(fā)生于青春期，以后隨著年齡的增加沉著量逐漸加大。
但是，該病在人的末梢神經(jīng)或自主神經(jīng)出現(xiàn)淀粉樣蛋白沉著，而在轉(zhuǎn)基因小鼠中則不出現(xiàn)。這是否由于小鼠與人的組織學(xué)特征存在差異，目前尚不清楚。由于這一原因，轉(zhuǎn)基因小鼠不出現(xiàn)臨床癥狀。
從這些小鼠的分析已經(jīng)清楚了解下面4點(diǎn)：①由tranethyretin分子組成的四聚復(fù)合體在血中的變化對淀粉樣蛋白的沉著是重要的；②淀粉樣蛋白中的微小成分即血清淀粉樣蛋白P成分不對淀粉樣蛋白沉著的開始、伸展、組織分布帶來任何影響；③各組織的微小環(huán)境，即血流量豐富度、組織密度對淀粉樣蛋白沉著量有較大的影響；④小鼠的飼育環(huán)境影響淀粉樣蛋白的沉著。該轉(zhuǎn)基因小鼠的關(guān)鍵問題是，末梢神經(jīng)和自主神經(jīng)并不發(fā)生淀粉樣蛋白沉著。闡明這一問題對今后開發(fā)治療方法將是重要的。
目前，轉(zhuǎn)基因疾病動物模型的研究大部分局限予單個(gè)基因的轉(zhuǎn)移。而生物學(xué)功能的表現(xiàn)以及疾病的發(fā)生通常是基因與基因之間相互作用的結(jié)果，故研究導(dǎo)致疾病和中醫(yī)證型的功能基因組，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作功能基因組動物模型更有意義。功能基因組動物模型的開發(fā)將隨著人類基因組計(jì)劃的完成而逐步得以實(shí)現(xiàn)。
基因治療動物模型
基因治療(gene therapy)即用分子生物學(xué)技術(shù)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正、補(bǔ)償基因缺陷或者抑制和阻斷異常基因的過度表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。基因治療包括基因補(bǔ)償、基因糾正、細(xì)胞因子基因?qū)搿⒎戳x核糖核酸技術(shù)等。該技術(shù)作為一種全新治療疾病的手段，發(fā)展極快，并有幾例已進(jìn)入臨床實(shí)用階段，解決了傳統(tǒng)方法無法解決的臨床難題。這一新穎獨(dú)特的治療方法，也是起源于對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究。
基因治療的動物模型制作，目前普遍采用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體法導(dǎo)入外源目的基因。這種重組的反轉(zhuǎn)錄病毒能將所攜帶的功能性基因整合到受體細(xì)胞染色體上，導(dǎo)入基因的表達(dá)產(chǎn)物將彌補(bǔ)原來缺少的基因產(chǎn)物。一種缺乏生長激素的小鼠，通常體型比一般小鼠小且雄性不育。將生長激素基因?qū)诉@種小鼠，通過外源生長激素基因的表達(dá)可使原來患“侏儒癥”(dwarf)的A、鼠個(gè)體增大3倍，而且可恢復(fù)雄性的繁殖力；缺乏主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)系列基因的小鼠對合成抗Ig缺乏免疫應(yīng)答，但轉(zhuǎn)MHC基因小鼠卻可恢復(fù)免疫應(yīng)答能力；有β地中海貧血的小鼠，導(dǎo)入小鼠或人的8球蛋白基因后，貧血程度得以減緩。
基因治療動物模型的制作，還可以采用導(dǎo)入反義基因方法。該方法適合于由某些基因異常表達(dá)引起的疾病。具體是將反義DNA注入受精卵，使之整合到染色體組并表達(dá)與致病mRNA序列互補(bǔ)的RNA，通過形成RNA雙鏈?zhǔn)怪虏RNA不能翻譯。人的神經(jīng)性震顫是由于髓磷脂堿性蛋白(MBP)減少而引起的疾病。將MBP的反義脫氧核糖核酸整合到小鼠染色體基因，其MBP合成降低為正常的50％～70％，因而出現(xiàn)震顫，制作了震顫動物模型。在小鼠中，也發(fā)現(xiàn)MBP缺損的突變體，表現(xiàn)自發(fā)的震顫。相反，在這些突變體中轉(zhuǎn)入MBP DNA，則形成髓磷脂堿性蛋白。當(dāng)這種mRNA表達(dá)量達(dá)到正常MBP量的25％以上時(shí)，癥狀消失，表現(xiàn)了明顯的癥狀回復(fù)(治療)以及發(fā)病與MBP表達(dá)水平的關(guān)系，為基因治療的轉(zhuǎn)基因動物制作提供了另一條途徑。
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