革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，于1884年由微生物學(xué)家Gram氏發(fā)明。經(jīng)過(guò)染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀(guān)察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類(lèi)鑒定。革蘭氏染色屬?gòu)?fù)染法。
革蘭氏染色的原理：通過(guò)甲基紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的配位化合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋甲基紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握乙醇脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌。而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。
簡(jiǎn)介
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師、細(xì)菌學(xué)家 Christain Gram創(chuàng)立。
細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用乙醇脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類(lèi)，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀(guān)察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅、稀釋酸性品紅等進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線(xiàn)菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽孢桿菌屬都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)芐青霉素敏感，革蘭氏陰性菌對(duì)鏈霉素敏感?？筛鶕?jù)革蘭氏染色法鑒別不同菌種并對(duì)癥下藥。
革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)檸檬酸鎂與多糖的配位化合物，它與碘和甲基紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類(lèi)菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類(lèi)菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽(yáng)性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。
染色原理
G﹢菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留甲基紫碘配位化合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，番紅染液復(fù)染后呈紅色。
染液組分
堿性染料
這在簡(jiǎn)單染色中已討論過(guò)，此處用結(jié)晶紫。
媒染劑
其作用是增強(qiáng)染料與細(xì)菌的親和力，更好地加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合。常用的媒染料是碘液。
脫色劑
幫助染料從被染色的細(xì)胞中脫色。利用細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同，而將細(xì)菌加以區(qū)分。革蘭陽(yáng)性細(xì)菌不易被脫色劑脫色，而革蘭陰性細(xì)菌則易被脫色。常用的脫色劑是丙或乙醇，這里所用的是95%的乙醇。
復(fù)染液
也是一種堿性染料，目的是使脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較。這里用的是番紅花水溶液。
實(shí)驗(yàn)步驟
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：
（1）載玻片固定。在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的載玻片上涂布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種并使其粘附固定。
（3）自來(lái)水沖洗，去掉浮色。
（4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鐘，傾去多余溶液。
（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽(yáng)性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無(wú)色。
（6）用蕃紅染液復(fù)染30秒，革蘭氏陽(yáng)性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開(kāi)。
固定目的
① 殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
② 保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉；
③ 改變菌體對(duì)染料的通透性，一般死細(xì)胞原生質(zhì)容易著色。
實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象
如果將細(xì)菌做革蘭染色，凡是染后菌體呈藍(lán)紫色的，稱(chēng)為“革蘭陽(yáng)性菌”；菌體是伊紅色，稱(chēng)“革蘭陰性菌”。無(wú)論陽(yáng)性菌還是陰性菌，都有桿菌和球菌。葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌是臨床最為常見(jiàn)的病原菌，葡萄球菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，大腸桿菌屬于革蘭陰性菌中的腸桿菌科，除大腸桿菌以外，臨床較常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌還有變形桿菌屬，沙門(mén)菌屬、克霉白菌屬；銅綠假單胞菌是臨床常見(jiàn)的較耐藥肺炎克雷伯菌。
實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌的不同顯色反應(yīng)是由于細(xì)胞壁對(duì)乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)決定的。經(jīng)甲基紫染色的細(xì)胞用碘液處理后形成不溶性配位化合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步結(jié)果是一樣的，但在G+細(xì)胞中，乙醇還能使厚的肽聚糖層脫水，導(dǎo)致孔隙變小，由于結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物分子太大，不能通過(guò)細(xì)胞壁，保持著紫色。在Gˉ細(xì)胞中，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜，于是被乙醇溶解的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物從細(xì)胞中滲漏出來(lái)，當(dāng)再用襯托的染色液復(fù)染時(shí)，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進(jìn)入已染成紫色的G+細(xì)胞，但被紫色蓋沒(méi)，紅色顯示不出來(lái)。
①革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁
G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達(dá)20層，占細(xì)胞壁成分的60%～90%，它同細(xì)胞膜的散逸層緊密相連（圖2-9）。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱(chēng)胞壁質(zhì)（murein），它是丙三醇和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽(yáng)離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，細(xì)胞生長(zhǎng)中有自溶素（autolysins）酶類(lèi)起作用，磷壁酸對(duì)自溶素有調(diào)節(jié)功能，阻止胞壁過(guò)度降解和壁溶。
如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體（protoplasts），細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外，大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。
②農(nóng)桿菌的細(xì)胞壁 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁?。?5～20nm）而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個(gè)明顯的空間，稱(chēng)為壁膜間隙（periplasmic space）。
外膜 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖（脂多糖,脂多糖），它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類(lèi)脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的糖類(lèi)分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由于糖的種類(lèi)不同，使各種Gˉ細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core 多糖）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G-細(xì)菌對(duì)高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱(chēng)為內(nèi)毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單
層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過(guò)脂蛋白連接起來(lái)。
壁膜間隙 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠態(tài)。其間含有三類(lèi)蛋白質(zhì)：水解酶，催化食物的初步降解；結(jié)合蛋白，啟動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；化學(xué)受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
革蘭染色的醫(yī)學(xué)意義：
1、可以協(xié)助鑒定細(xì)菌
2、為臨床使用抗生素提供依據(jù)
3、有助于了解分析細(xì)菌的致病性
影響因素
操作因素
1、涂片太厚 在涂片時(shí)細(xì)菌挑的太多，沒(méi)法分開(kāi)，在脫色時(shí)就不能將第一步染上的甲基紫的顏色脫去，可能會(huì)使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
2、脫色時(shí)間 陽(yáng)性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結(jié)果，如果延長(zhǎng)脫色時(shí)間，也會(huì)使脫色劑滲透進(jìn)陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上酸性品紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短的話(huà)又會(huì)使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能完全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
3、固定方法 固定不僅能殺死細(xì)菌，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，還能使細(xì)菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細(xì)菌涂片以中等速度通過(guò)火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的同學(xué)將玻片在火焰上烤的太久，改變了細(xì)菌原有的通透性，會(huì)使細(xì)菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
細(xì)菌因素
1、細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間 細(xì)菌的典型形態(tài)、染色性是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取這時(shí)的細(xì)菌做革蘭染色可以反應(yīng)細(xì)菌的真實(shí)的染色性。如果細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，變成了老齡菌，染色性就會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
2、培養(yǎng)基的成分 一般認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)檸檬酸鎂與多糖的配位化合物，它與碘和甲基紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細(xì)菌與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
染液因素
1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長(zhǎng)，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細(xì)菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
2、結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會(huì)使染上的顏色不容易被乙醇脫色，可能會(huì)使革蘭陰性菌染成革蘭陽(yáng)性菌。
3、酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽(yáng)性菌染上的甲基紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當(dāng)酒精的濃度為70% 時(shí)，它的脫色能力最強(qiáng)，可能使革蘭陽(yáng)性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
參考資料 >
革蘭氏染色的原理及染色液的配制.北京索萊寶科技有限公司.2024-02-07
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四步法革蘭染色的步驟詳細(xì)介紹.北京索萊寶科技有限公司.2024-02-07