逆轉錄(reverse transcription)是以RNA(核糖核酸:Ribonucleic Acid)為模板在逆轉錄酶催化下合成DNA(脫氧核糖核酸:DeoxyriboNucleic Acid)的過程。逆轉錄酶是RNA定向DNA聚合酶,是一種由逆轉錄病毒遺傳物質編碼的酶,對逆轉錄病毒RNA轉錄成DNA進行催化,這種催化轉錄是正常細胞將DNA轉錄成RNA的逆過程,因此被稱為逆轉錄。
逆轉錄酶是逆轉錄病毒感染屬性的核心,其中一些會導致人類疾病,包括導致免疫缺陷病(艾滋病)的人類免疫缺陷病毒(HIV)和導致白血病的人類T細胞淋巴營養病毒I型(HTLV-I)。逆轉錄酶也是被稱為逆轉錄聚合酶鏈反應RT-PCR實驗室技術的基本組成部分,RT-PCR是用于研究和診斷癌癥等疾病的有力工具。逆轉錄過程是核糖核酸病毒的復制形式之一,在真核生物中也同樣存在。逆轉錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發現,是對中心法則的重要修正和補充。分子生物學的中心法是描述從一個基因到相應蛋白質的信息流途徑,遺傳信息貯存在脫氧核糖核酸中,DNA被復制傳給子代細胞,信息被拷貝或由DNA轉錄成RNA,然后RNA翻譯成多肽,最后形成蛋白。而逆轉錄表明RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達功能。
1970年,美國遺傳學家霍華德·特明(Howard Temin)、日本生物學家水谷哲(Satoshi Mizutani)以及美國生物學家戴維·巴爾的摩(David Baltimore)分別獨立發現了一種可以從RSV的核糖核酸基因組合成前病毒DNA的酶,這種酶被稱為RNA定向DNA聚合酶,即反轉錄酶。1975年,特明、巴爾的摩和雷納托·杜爾貝科(同時指導特明和巴爾的摩)因“發現腫瘤病毒和細胞的遺傳物質之間的相互作用”而獲得諾貝爾生理學或醫學獎。
簡介
逆轉錄(reverse transcription)是RNA病毒的復制形式,需逆轉錄酶的催化。艾滋病(HIV)就是一種典型的逆轉錄病毒。
逆轉錄與反轉錄嚴格意義上來說沒有什么區別,但是逆轉錄是核糖核酸類病毒自主行為,在整合到宿主細胞內以RNA為模板形成脫氧核糖核酸的過程;反轉錄是進行基因工程過程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過程。二者雖同為RNA→DNA的過程,但地點不同,相對性的來說,逆轉錄在體內,反轉錄在體外。
過程
逆轉錄過程由逆轉錄酶催化,該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA(complementary DNA, cDNA)。反轉錄酶存在于一些核糖核酸病毒中,可能與病毒的惡性轉化有關。人類免疫缺陷病毒(HIV)也是一種RNA病毒,含有逆轉錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有逆轉錄酶,推測可能與細胞分化和胚胎發育有關。
大多數反轉錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①脫氧核糖核酸聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為賴氨酸的轉運RNA,在引物tRNA 3'-末端以5'→3'方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3'→5'外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNase H活性;由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板核糖核酸形成的雜交分子,將由RNase H從RNA 5'端水解掉RNA分子。③DNA指導的DNA聚合酶活性;以反轉錄合成的第一條脫氧核糖核酸單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子。除此之外,有些逆轉錄酶還有DNA內切酶活性,這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發現對于遺傳工程技術起了很大的推動作用,它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板,在逆轉錄酶的作用下,合成出互補的cDNA,由此可構建出cDNA文庫(cDNA library),從中篩選特異的目的基因,這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法。
簡要過程表示
逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物,以核糖核酸為模板,轉運RNA(主要是色氨酸tRNA)為引物,在tRNA3'-末端上,按5'→3'方向,合成一條與RNA模板互補的cDNA單鏈,它與RNA模板形成RNA-cDNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下,水解掉RNA鏈,再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此,完成由RNA指導的脫氧核糖核酸合成過程。
病毒復制方式
逆轉錄病毒(屬于RNA病毒):RNA→DNA→RNA
包括RNA腫瘤病毒科、慢病毒屬科和泡沫反轉錄病毒亞科科,廣為人知的有人類免疫缺陷病毒(HIV)和人類嗜T細胞病毒(HTLV)。此類病毒遺傳物質為線狀的正鏈核糖核酸,自帶逆轉錄酶和整合酶。病毒進入細胞后,以正鏈RNA為模板,逆轉錄合成雙鏈DNA,雙鏈DNA由整合酶整合至染色體DNA上形成前病毒。前病毒活化時,轉錄出作為病毒遺傳物質的正鏈RNA和mRNA。
擬逆轉錄病毒(屬于脫氧核糖核酸病毒):DNA→RNA→DNA
包括嗜肝DNA病毒科和花椰菜花葉病病毒科,廣為人知的乙型肝炎病毒(HBV)即屬于此類。此類病毒的遺傳物質為部分單鏈和部分雙鏈的環狀DNA,即rcDNA。病毒進入細胞后,rcDNA進入細胞核,轉換成完整的雙鏈環狀DNA,并形成超螺旋結構,即cccDNA。cccDNA轉錄出多種mRNA,其中一種是前基因組RNA。合成反轉錄酶后,以前基因組核糖核酸為模板,逆轉錄合成病毒的遺傳物質脫氧核糖核酸。
意義
逆轉錄的發現有重要的理論意義和實踐意義。
(1)對分子生物學的中心法則進行了修正和補充。經典的中心法則認為:DNA的功能兼有遺傳信息的傳遞和表達,因此,DNA處于生命活動的中心位置。逆轉錄現象說明:至少在某些生物,RNA同樣兼有遺傳信息傳遞和表達功能。修正后的中心法則表示為:是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA,再從RNA傳遞給蛋白質,即完成遺傳信息的轉錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA,即完成DNA的復制過程。這是所有有細胞結構的生物所遵循的法則。某些病毒中的核糖核酸自我復制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉錄成脫氧核糖核酸的過程(某些致癌病毒)。有些蛋白質病毒(即朊病毒,如牛海綿狀腦病病毒)以蛋白質直接形成蛋白質(如瘋牛病病毒是一種因錯誤折疊而形成的結構異常的蛋白質,可促使與自身具有相同氨基酸序列的蛋白質發生同樣的折疊錯誤,從而導致大量結構異常的蛋白質的形成)。
(2)在致癌病毒的研究中發現了癌基因,在人類一些癌細胞如膀胱癌、小細胞癌等細胞中,也分離出與病毒癌基因相同的堿基序列,稱為細胞癌基因或原癌基因。癌基因的發現為腫瘤發病機理的研究提供了很有前途的線索。
(3)在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉錄產物易于制備,可將mRNA反向轉錄形成脫氧核糖核酸用以獲得目的基因。
參考資料 >
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一只雞引發的癌癥起因大探索.今日頭條.2024-02-22
一步法miRNA反轉錄試劑盒|新海基因檢測有限公司.逆轉錄.2021-07-19