卵黃抗體（Immunoglobulin of yolk, IgY）：通過(guò)免疫注射產(chǎn)蛋雞，即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)的抗體，并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療，這類(lèi)制劑稱(chēng)為卵黃抗體。
形成原因
鳥(niǎo)綱的免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫，分別受胸腺和法氏囊的控制。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)抗原刺激后，法氏囊內(nèi)的B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞，分泌特異性抗體進(jìn)入血液循環(huán)，當(dāng)血液流經(jīng)卵巢時(shí)，特異性抗體在卵細(xì)胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體；當(dāng)卵細(xì)胞分泌進(jìn)入輸卵管時(shí)，流經(jīng)輸卵管的血液中含有的特異性抗體(主要是IgA和IgM)進(jìn)入卵清中，形成卵清抗體。血清抗體移行進(jìn)入卵細(xì)胞是受體作用的結(jié)果，因而血清抗體可在卵細(xì)胞中大量蓄積，濃度高于血液中的抗體。與卵黃抗體相比，卵細(xì)胞在輸卵管中移行的時(shí)間較短，因而卵清抗體含量極微。卵黃抗體在禽胚孵化過(guò)程中逐漸進(jìn)入禽胚血液，為剛出殼雛雞提供被動(dòng)免疫保護(hù)，在雛雞疾病預(yù)防中具有重要作用，但同時(shí)也會(huì)干擾雞新型冠狀病毒疫苗的免疫效果。
抗體性質(zhì)
IgY的性質(zhì)與哺乳綱的IgG相似。正常雞IgY的分子量約為180KDa，由兩條輕鏈(2L)和兩條重鏈(2H)組成，分子量分別為60-70KDa和22-30KDa。其等電點(diǎn)約為5.2。
IgY與一般哺乳動(dòng)物IgG相比，IgY具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸、抗離子強(qiáng)度和一定的抗酶降解能力。
在低于75℃條件下，IgY具有良好的熱穩(wěn)定性。IgY制劑在4℃貯存5年或在室溫貯存6個(gè)月其活性仍無(wú)明顯變化或下降，65℃時(shí)可保持24h以上，70℃時(shí)加熱90min后其活性才明顯下降60℃，30min條件下巴氏消毒不影響IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。
IgY在pH4.0-11.0時(shí)比較穩(wěn)定，磷化氫0-3.5時(shí)活性迅速下降，pH12時(shí)活性亦有所下降。
IgY對(duì)胃蛋白酶有較高的抵抗力，但對(duì)胰蛋白酶十分敏感。將胃蛋白酶和IgY在pH2.0溫育1h后，幾乎所有活性喪失，但在pH4.0時(shí)1h后可保持91%的活性，甚至溫育10h后仍有63%活性。IgY分別與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8h，活性分別保持39%和41%。
作用機(jī)理
特定病原菌的卵黃抗體能直接黏附于病原菌的細(xì)胞壁上，改變病原細(xì)胞的完整性，直接抑制病原菌的生長(zhǎng)；卵黃抗體可黏附于細(xì)菌的菌毛上，使之不能黏附于腸道黏膜上皮細(xì)胞；一部分卵黃抗體在腸道消化酶作用下，降解為可結(jié)合片段，這些片段含有抗體的可變小肽(Fab)部分，這些小肽很容易被腸道吸收，進(jìn)入血液后能與特定的病原菌黏附因子結(jié)合，使病原菌不能黏附易感細(xì)胞而失去致病性，而IgY的穩(wěn)定區(qū)(Fe部分)留在腸內(nèi)。
分離提純方法
卵黃中的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，其比例為1：2。大部分蛋白質(zhì)都是脂蛋白，存在于卵黃顆粒中，不溶于水，只有卵黃球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黃球蛋白。因此IgY的分離純化首先需要有效地去除卵黃中的脂類(lèi)，從水溶性蛋白中分離IgY。
多年來(lái)，已建立了許多較為高效而經(jīng)濟(jì)的方法，這些方法大多以聚乙二醇、硫酸葡聚糖、天然膠，如海藻酸鈉、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步純化蛋白質(zhì)。
1980年，Polson首先提出聚乙二醇(PEG)兩步沉淀法，分別用終濃度為3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸銨鹽析法去除PEG。1985年，在此基礎(chǔ)上提出了冷乙醇沉淀的改進(jìn)方法，使產(chǎn)量提高，而且能有效地去除殘留PEG。1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法)，PEG法和DS法的產(chǎn)量相當(dāng)，但提取的IgY制品含有一定量的雜蛋白。Bade和Stegemann(1984)用預(yù)冷的丙和丙(-20℃)沉淀蛋白質(zhì)并去除脂質(zhì)，經(jīng)DEAE柱層析進(jìn)一步純化，其IgY抗體活性與用Polson法提純的IgY之間無(wú)明顯差別，且穩(wěn)定性好，經(jīng)3次以上凍融，抗體活性未見(jiàn)改變。1992年Akita等用水稀釋法(WD)提純IgY，每個(gè)卵黃可獲得100mg以上的IgY。此后，Akita等比較了WD法、PEG法、DS法和黃原膠法(Xanthan法)的提純效果，結(jié)果表明：WD法產(chǎn)量最高，其次為DS法，WD法更適合大規(guī)模生產(chǎn)。
1993年，Horikoshi提出了冷乙醇分級(jí)離心的方法，分別用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀離心，得到純度達(dá)99%以上的IgY。此法適用于大規(guī)模制備IgY。
工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)IgY的方法有：超臨界二氧化碳氣體抽提法、卡拉膠法、硫酸鹽析法。
抗體應(yīng)用
人類(lèi)疾病
IgY在人類(lèi)疾病防治方面的應(yīng)用
抗人腹瀉病大腸桿菌IgY可使大腸桿菌聚集，從而抑制細(xì)菌的繁殖和生長(zhǎng)，并促進(jìn)大腸桿菌從腸道的排除。人輪狀病毒(HRV)是引起嬰兒和兒童腸道疾病的主要病原體，在食品中添加抗人輪狀病毒IgY可防止食品污染，對(duì)人體起到被動(dòng)免疫保護(hù)作用。近年來(lái)，不少學(xué)者用HRV侵染的乳鼠為模型，進(jìn)行了抗HRV-IgY的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。Hatta等檢測(cè)了3種主要的消化道酶對(duì)抗HRV-IgY的作用及抗HRV-IgY對(duì)侵染HRV的保護(hù)作用。將胃雖白酶和IgY于pH2.0溫育1h，IgY的中和滴度喪失100%，而于pH4溫育1h，仍保存91%的活性，甚至10h仍有63%的活性。IgY分別與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶溫育8小時(shí)，活性保存39%和41%，說(shuō)明IgY一定時(shí)間內(nèi)可對(duì)抵抗兩種酶的消化作用。5月齡嬰兒胃液的pH值不能使抗HRV-IgY的活性受到嚴(yán)重?fù)p失，在食品添加抗HRV-IgY。完全可能為嬰兒提供有效的被動(dòng)免疫保護(hù)。5月齡以?xún)?nèi)的嬰兒及先天免疫缺陷病癥患兒口服高效抗病毒IgY可用于疾病的防治，尤其對(duì)不能進(jìn)行母乳哺育的幼兒的疾病防治具有重要意義。但是對(duì)于年齡較大的人來(lái)說(shuō)，必需對(duì)IgY進(jìn)行保護(hù)，避免其在消化道中被破壞。用脂質(zhì)體包埋lgY可有效抵抗酸性環(huán)境中胃蛋白酶的消化，使IgY口服防治疾病成為可能。
IgY在人類(lèi)疾病診斷方面的應(yīng)用
IgY是理想的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工具，不僅可以制備針對(duì)特定病原生物的特異性抗體，用于對(duì)病原體的分離、鑒定，且不結(jié)合類(lèi)風(fēng)濕因子、不與蛋白A、蛋白G、哺乳綱F受體、補(bǔ)體結(jié)合，與IgG幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)。因此應(yīng)用于針對(duì)循環(huán)免疫復(fù)合物、類(lèi)風(fēng)濕因子和補(bǔ)體等的特異性測(cè)定，有效地減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。在診斷用特異性抗體制備方面，Yurie Motoi等成功制備特異性IgY診斷狂犬病毒，利用基因重組技術(shù)，將重組的狂犬病病毒CVS-11鏈在大腸桿菌中表達(dá)，再用來(lái)免疫產(chǎn)蛋雞，通過(guò)免疫方法檢測(cè)，IgY與病毒結(jié)合好，敏感性高。Dr.Lonardo等用雞IgY和兔血清抗體IgG作對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Western印跡和免疫沉淀反應(yīng)中IgY比IgG能更有效地識(shí)別抗原表位；在免疫細(xì)胞化學(xué)法中，只有IgY能夠在HPV16陽(yáng)性的細(xì)胞中特異性地定位E7蛋白(人乳突狀瘤病毒的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。Terzdo等試驗(yàn)表明，利用抗沙門(mén)氏菌屬出血型腸炎株的特異性IgY檢測(cè)沙門(mén)氏菌腸出血型腸炎株，特異性高，效果理想。
動(dòng)物疾病
IgY在動(dòng)物疾病防治方面的應(yīng)用
研究表明，IgY能抵抗幼齡動(dòng)物腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。故常在幼畜飼料或添加劑中加入一定量的針對(duì)某些特定疾病的IgY，以使其獲得有效的被動(dòng)免疫。何月英等利用小鵝瘟強(qiáng)毒制備的卵黃抗體，對(duì)2-3日齡雛鵝進(jìn)行預(yù)防，其保護(hù)率高達(dá)100%。楊曉梅等用鴨病毒性肝炎I型雞胚毒免疫雞，制備的雞抗鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體，經(jīng)實(shí)際應(yīng)用于預(yù)防時(shí)，雛鴨的平均成活率為96.9%。
IgY在動(dòng)物疾病治療方面的應(yīng)用
目前，卵黃抗體己被廣泛應(yīng)用于許多疾病的防治。汪銘書(shū)應(yīng)用抗鴨病毒性肝炎(DHV)的卵黃抗體治療人工感染的鴨時(shí)，當(dāng)用1萬(wàn)倍LD50強(qiáng)毒時(shí)保護(hù)率可達(dá)到100%。張英等用抗小鵝瘟的卵黃抗體治療發(fā)病鵝群，治愈率為95.2%。此外，應(yīng)用多種病原菌免疫制備的卵黃抗體還可以防治多種病原菌的感染。詹麗娥等用IBD、ND和EDS-76三聯(lián)高免卵黃抗體治療上述三種疾病，總有效率可達(dá)50%以上。日本成功地從雞蛋中提取出能夠殺死螺旋菌的抗體，并以這種抗體為原料制成了能殺死人體內(nèi)幽門(mén)螺旋桿菌的酸奶。
用卵黃抗體治療疾病，安全、高效且無(wú)公害，我國(guó)已有商品化的卵黃抗體供應(yīng)。
IgY在動(dòng)物疾病診斷方面的應(yīng)用
卵黃抗體和哺乳綱免疫球蛋白有許多不同之處，如它不與金黃色葡萄球菌A蛋白結(jié)合，不與哺乳動(dòng)物Fc受體結(jié)合，對(duì)哺乳動(dòng)物補(bǔ)體無(wú)固定作用等，這使得卵黃抗體在檢測(cè)診斷上具有更強(qiáng)的特異性和靈敏度，所以卵黃抗體可以應(yīng)用于免疫熒光試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳等。鄭厚旌等用卵黃瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)卵黃中的IBD抗體水平，結(jié)果表明用卵黃瓊擴(kuò)試驗(yàn)替代血清瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)IBD抗體水平是可行的，并且具有經(jīng)濟(jì)、省力、省時(shí)的特點(diǎn)。此外卵黃抗體有望取代傳統(tǒng)的多克隆抗體的生產(chǎn)，獲取大量更有效的抗體，同時(shí)也可減少對(duì)動(dòng)物的副反應(yīng)，提高動(dòng)物的福利。
開(kāi)發(fā)前景
IgY作為替代抗生素的新型飼料添加劑正在引起人們的關(guān)注，IgY取代抗生素用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，是一種安全的綠色添加劑。
生產(chǎn)技術(shù)較為成熟：用雞卵黃大量生產(chǎn)、制備多克隆抗體是近年來(lái)抗體制備技術(shù)中新興的研究領(lǐng)域。
IgY產(chǎn)量高，價(jià)格低廉。
使用IgY技術(shù)生產(chǎn)免疫球蛋白，可以減少對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激，提高動(dòng)物的福利。
年齡較大的動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致IgY分解失活，然而通過(guò)包埋處理可避免這一問(wèn)題。Shimizu等(1993)用脂質(zhì)體包埋IgY，在pH2.8的胃蛋白酶中37℃溫育1h，包埋的IgY仍可保存80%的活性。
綜上所述，雞卵黃免疫球蛋白是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，而且雞大規(guī)模工業(yè)化飼養(yǎng)成本低，經(jīng)濟(jì)方便，同時(shí)制備IgY的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，IgY在生物制品的開(kāi)發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。應(yīng)用卵黃抗體防治疾病也有不可避免的缺點(diǎn)，如可能帶有蛋傳染性疾病的病原，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)存在潛在的威脅。
參考資料 >