乳過(guò)氧化物酶(Lactoperoxidase，EC1.11.1.7，簡(jiǎn)稱(chēng)LP)是存在于乳汁中的一種血紅素蛋白，是一種來(lái)自動(dòng)物的過(guò)氧化物酶，在初乳中含量尤其豐富。乳過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫以及硫酸根(SCN)可以形成“乳過(guò)氧化物酶體系(LPS)”。這個(gè)酶系統(tǒng)具有抑菌活性，可以在沒(méi)有冷藏的條件下，抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)鮮乳的保質(zhì)期，具有“冷殺菌”的作用。乳中的LPS不僅具有抗菌作用，還可預(yù)防過(guò)氧化氫等過(guò)氧化物的積累，從而避免了過(guò)氧化物引起的細(xì)胞損傷，起到保護(hù)乳腺的作用。
存在部位
LP是過(guò)氧化物酶家族的成員之一，是存在于乳汁中的一種血紅素蛋白，是人乳和牛乳中非常常見(jiàn)的成份之一，在哺乳綱的乳腺、唾液腺、淚腺及其分泌物中都能找到。
結(jié)構(gòu)
LP是由一條多膚鏈構(gòu)成的，包括612個(gè)氨基酸殘基，分子量大約是78kD，等電點(diǎn)為9.6，是一種堿性蛋白，也是一種糖蛋白。它含有一個(gè)血紅素和大約10%的碳水化合物，其催化活性中心的血紅素是一個(gè)原葉琳ix，通過(guò)一個(gè)酷鍵共價(jià)連接到多膚鏈上構(gòu)成的。LP中鐵含量是0.07%，鐵是血紅素的一部分，每個(gè)LP分子對(duì)應(yīng)一個(gè)鐵。研究發(fā)現(xiàn)，LP結(jié)構(gòu)中二硫鍵的破壞和硫酸亞鐵血紅素的存在與否直接影響LP的活性和穩(wěn)定性。
濃度及活性
在牛乳中，LP是僅次于黃嚓吟氧化酶第二豐富的酶，它在乳中的濃度大約是30mg/L。有報(bào)道，LP含量的改變與牛的生殖周期、季節(jié)、品種和喂養(yǎng)制度有關(guān)，需要注意，不像其它抗菌蛋白，LP的含量在牛初乳中是較低的，但在產(chǎn)后3~5天LP含量迅速增加以達(dá)到最大值。不同來(lái)源乳中的LP的活性不同，可以看到牛乳中LP的平均活性為2.3U/mL;人乳中LP的活性較低，為0.67一0.97u/mL;豚鼠的LP具有最高的活性，達(dá)到22u/mL。據(jù)報(bào)道，LP的酶活力必須達(dá)到0.02U/mL以上才具有抑菌活性。
理化性質(zhì)
存在于乳腺、淚腺、唾液腺中的LP在化學(xué)上和免疫學(xué)上的性質(zhì)都是類(lèi)似的。LP參與抑制微生物生長(zhǎng)首先被Hanssen提出，他指出LP參與構(gòu)成宿主對(duì)抗入侵微生物的天然防御系統(tǒng)。除此之外，LP還具有抗菌活性、降解各種致癌物質(zhì)以及保護(hù)動(dòng)物細(xì)胞被過(guò)氧化的能力。LP是乳中熱穩(wěn)定性的酶之一，它的破壞已經(jīng)被作為巴氏滅菌效力的指標(biāo)之一。Mark證實(shí)了常規(guī)的巴氏滅菌不能讓乳中的LP失活，但是，LP在酸性條件下(pH5.3)的熱穩(wěn)定性會(huì)降低，可能是由于鈣從分子中釋放出來(lái)，看來(lái)鈣離子濃度對(duì)LP的熱穩(wěn)定性有較大影響。LP對(duì)許多蛋白質(zhì)水解酶都是相對(duì)穩(wěn)定的，但是，在維生素B2存在下LP對(duì)光特別敏感。
體系LPS
組成成分
所謂LPS必須同時(shí)包括3種組成成分，即乳過(guò)氧化物酶，硫氰酸鹽和過(guò)氧化氫。只有這三種成分共同作用才具有抗菌活性。在實(shí)際應(yīng)用中，若體系中的某一組分濃度不夠時(shí)，則需要添加外源或設(shè)法生成，以保證抗菌效果，這就是LPS的“激活”。其中，乳過(guò)氧化物酶的濃度不低于0.02U/mL。牛乳中天然的LP的濃度為1.4U/mLL，水牛乳中為0.9U/mL可滿(mǎn)足這一要求。因此，無(wú)須添加外源，而硫氰酸鹽廣泛存在于動(dòng)物的組織和分泌液中，乳中的硫氰酸鹽來(lái)自血液，濃度僅為3-5μg/mL，成為限制因素。據(jù)報(bào)道，激活LPS所需的硫氰酸鹽的濃度約為15μg/mL或以上，所以要激發(fā)LPS需要添加外源。在剛擠出的牛乳中過(guò)氧化氫含量?jī)H為1-2μg/mL，而激活需8-10μg/mL的過(guò)氧化氫，必須外源供給過(guò)氧化氫。
抑菌效果
LPS的抗菌性是表現(xiàn)在對(duì)乳中一些微生物具有抑菌或殺菌作用其抗菌機(jī)理是微生物細(xì)胞質(zhì)膜上的琉基基團(tuán)被氧化，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)破壞，鉀離子、氨基酸和多膚泄露，使細(xì)胞對(duì)葡萄糖、氨基酸、漂吟、嚓陡的攝取以及蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸和核糖核酸的合成受到了抑制口l。抗菌因素與供電體、介質(zhì)、溫度、PH值的不同以及從氧化物的脫氧到糖酵解途徑的堵塞或干涉細(xì)胞病變等有關(guān)。
不同的細(xì)菌對(duì)LPS的敏感程度不同。革蘭氏陰性，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)菌，如假單胞菌屬，大腸桿菌，沙門(mén)氏菌屬不僅能被抑制，在PH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量不同時(shí)，還能被殺死。革蘭氏陰性菌如鏈球菌屬和乳酸菌往往只能被抑制。細(xì)菌受LPS影響程度的不同可能與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和特性不同有關(guān)。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜比革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜更容易被LPS破壞。致使一些營(yíng)養(yǎng)成份泄漏，妨礙了細(xì)菌自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)的攝取，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡或衰退。
從山羊乳中純化出的LPO在硫氰酸鹽和過(guò)氧化氫的媒介中表現(xiàn)出強(qiáng)的抗真菌能力。山羊乳中的LPS可以抑制黃曲霉、木霉屬的生長(zhǎng)繁殖。山羊乳中的LPS還能抑制曲霉屬、交鏈包霉屬、產(chǎn)黃青霉菌和麥角菌屬。
檢測(cè)
鑒于其重要的應(yīng)用價(jià)值，因此測(cè)定LP活性尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)LP檢測(cè)方法的研究較多，大多是基于顏色反應(yīng)，利用酶促反應(yīng)原理，借助分光光度計(jì)測(cè)定酶活大小。
苯胺類(lèi)檢測(cè)LP活性
以苯胺類(lèi)為底物測(cè)定過(guò)氧化物酶活性，其原理為在過(guò)氧化物酶存在時(shí)，H2O2可使苯胺發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，產(chǎn)物為棕褐色物質(zhì)。該物質(zhì)于415nm波長(zhǎng)下有最大光吸收，因此利用分光光度法測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，以吸光度的變化速率來(lái)表征過(guò)氧化物酶活力。
愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)
愈創(chuàng)木酚檢測(cè)方法的原理，在LP催化作用下，過(guò)氧化氫氧化愈創(chuàng)木酚，產(chǎn)物為醌類(lèi)化合物，此化合物可進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，生成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚。利用愈創(chuàng)木酚檢測(cè)方法測(cè)定LP時(shí)要求嚴(yán)格控制時(shí)間，檢測(cè)過(guò)程中用酸終止酶促反應(yīng)，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果明顯偏低。
ABTS法檢測(cè)
ABTS主要用來(lái)測(cè)量和表征抗氧化劑抗氧化能力，是近些年興起的一種相對(duì)簡(jiǎn)便的用于體外測(cè)定物質(zhì)總抗氧化能力的方法。最初由Marklund提出，用含有蛋白質(zhì)的血紅素過(guò)氧化物酶與ABTS反應(yīng)生成ABTS+，用于測(cè)定樣品中血紅蛋白的含量，目前已廣泛應(yīng)用于包括血清類(lèi)的生物樣品、果蔬類(lèi)和一些純物質(zhì)抗氧化能力的測(cè)定。利用ABTS法檢測(cè)LP的原理如下：在LP的催化作用下，過(guò)氧化氫可將無(wú)色的還原型ABTS氧化，生成的氧化型ABTS為綠色物質(zhì)，該綠色物質(zhì)于416nm波長(zhǎng)附近有最大光吸收。根據(jù)顏色的深淺，借助于可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)定反應(yīng)的吸光度，進(jìn)而換算待測(cè)樣的酶活或酶濃度。
TMB法檢測(cè)
TMB因其安全性和較高的敏感性，正逐步取代有致癌性的ABTS顯色劑用于LP的檢測(cè)中。TMB檢測(cè)法的原理是在過(guò)氧化物酶存在條件下，TMB能被過(guò)氧化氫氧化生成明亮的藍(lán)色物質(zhì)，已知該有色物質(zhì)于波長(zhǎng)655nm下有最大吸收峰。根據(jù)顏色的深淺，借助分光光度計(jì)，測(cè)定反應(yīng)的吸光度，進(jìn)而換算待測(cè)樣的酶活或酶濃度。
免疫學(xué)方法
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）即將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。ELISA方法是近30年來(lái)發(fā)展起來(lái)的綜合性酶免疫化學(xué)分析方法，采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定抗原或者抗體。使用該測(cè)定方法有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）、酶作用的底物（顯色劑）。
參考資料 >