分光光度計（Spectrophotometer），是利用物質對光的選擇吸收現象，進行物質定性和定量分析的儀器。主要由光源、單色器、樣品室及吸收池、檢測系統和顯示系統組成。光源產生的復合光，通過單色器被分解為單色光。當單色光通過樣品時，一部分被吸收，其余未被吸收的光到達檢測系統轉變為電信號，經放大和數據處理后，通過顯示系統使人們得到測量的結果。
1665年，艾薩克·牛頓（Isaac Newton）使用三棱鏡分解太陽光；1760年，朗伯（J.H.Lambert）提出朗伯定律，指出物質對光的吸收與物質的厚度成正比；1815年，約瑟夫·馮·夫瑯和費（J.Fraunhofer）發現了太陽光譜中的夫瑯和費線；1852年，比耳（A.Beer）提出比耳定律，指出物質對光的吸收與物質的濃度成正比。朗伯定律和比耳定律的結合構成了朗伯-比耳定律，為分光光度法的發展提供了理論基礎。20世紀初，美國科學家阿諾德·奧爾德福·貝克曼（Arnold J. Beckman）等人發明了第一臺商業化分光光度計，并于1940年推出了D型（DU型）分光光度計。自20世紀70年代起，分光光度計開始實現自動化和數字化。隨著技術和材料的不斷更新，分光光度計的類型也在不斷迭新，以滿足不同領域和不同應用的需求。
在科研領域中，分光光度計常用于物質鑒定、反應動力學研究和化合物組成及穩定常數的測定等方面。在食品檢驗領域，分光光度計通過對食品中的復合型防腐劑、復合型鮮味劑等成分的分析完成對食品成分的定性與定量檢測。在環境監測中，分光光度計可被用于廢水中苯酚的濃度測定和大氣污染監測中的臭氧含量觀測，通過定量測定的方法為環境保護提供數據支撐。在造紙工業領域，分光光度計被廣泛應用于單組份有色物定量分析、多組分混合物分析以及木質素測定。在醫藥產業中，分光光度計可用于藥物規格檢驗、中藥品質鑒定、雜質控制、反應監測以及添加劑質量檢測，以確保所生產的藥物質量符合標準。
發展歷史
早期理論探索（17世紀至19世紀初）
1665年，英國科學家艾薩克·牛頓（Isaac Newton）首次使用三棱鏡將太陽光分解成紅、橙、黃、綠、藍、、紫的色帶，證明了太陽光是復合光。
1760年，朗伯（J.H.Lambert）發現物質對光的吸收與物質的厚度成正比，即光透過物質時，其強度隨著物質厚度的增加而指數遞減，被稱為朗伯定律。
1815年，約瑟夫·馮·夫瑯和費（J.Fraunhofer）發現太陽光譜中有600多條暗線，并且對主要的8條暗線標以A、B、C、D、E、F、G、H符號。這些暗線被稱為“夫瑯和費線”（Fraunhofer 譜線）。
1852年，比耳（A.Beer）在又發現物質對光的吸收與物質的濃度成正比，被稱為比耳定律。人們把朗伯定律和比耳定律結合起來，稱之為朗伯-比耳定律，簡稱比耳定律。朗伯-比耳定律提供了一種更全面的描述物質對光的吸收的方法，成為了分光光度法的理論基礎，為分析化學領域的發展做出了重要貢獻。
第一臺分光光度計的誕生（20世紀初）
1940年，美國國家技術實驗室的阿諾德·奧爾德福·貝克曼（Arnold J. Beckman）等人發明了第一臺商業化分光光度計。
最初的分光光度計因存在性能問題而進行了多個型號的改進。 B型分光光度計使用石英棱鏡代替玻璃棱鏡，提高了設備??的紫外線能力。 C型分光光度計提高了UV中的波長分辨率。 D型（又稱為DU型）分光光度計采用氫燈和其他改進技術生產，并一直保持該設計至1976年停產。
相比與之前的化學分析方法，DU分光光度計分析耗時短至數分鐘，且準確度高達99%。諾貝爾化學獎得主布魯斯·梅里菲爾德（Bruce Merrifield）曾評價分光光度計“可能是有史以來為推動生物科學發展而開發的最重要的儀器”。
技術進步和應用拓展（20世紀中期起）
20世紀60年代，雙光束的分光光度計問世，進一步提高了分析的精度和效率。
20世紀70年代，隨著微型計算機的引入，分光光度計開始實現自動化和數字化，提高了數據處理速度和準確度。微型計算機的應用使得分光光度計的性能更加優越，功能得到了進一步擴大，應用范圍更加廣泛。
自20世紀70年代起，在技術和材料的不斷更新下，分光光度計的種類、型式、結構也在不斷地更新和改進。根據使用的波長范圍、單色器和檢測器類型、光路的差異、進樣系統的不同以及讀數系統的多樣性，科學家設計出多種多樣的分光光度計以滿足不同領域和不同應用的需求。
理論基礎和工作原理
電磁輻射
20世紀初，馬克斯·普朗克（Max Planck）提出了量子論，說明光既是粒子又是一種電磁波，并提出光量子（光子）能量與電磁輻射的頻率有關，表達式為：
式中，為輻射的光子能量（單位：）；為普朗克常數（）；為輻射的頻率（單位：）；為光速（）；為波長（單位：）。該式將粒子說的光子能量與波動說的輻射頻率（波長）聯系到一起，用于計算各種頻率或波長光子的能量。
原子或分子中的電子，總是處在某一種運動狀態之中。每一種狀態都具有一定的能量，屬于一定的能級。這些電子由于各種原因，如光、熱、電等的激發，放出光或放出熱，而從一個能級轉移到另一個能級，稱之為躍遷。當這些電子吸收了外來輻射的能量后，就會從能量較低的能級躍遷到另一個能量較高的能級。因此，每一躍遷都對應著吸收一定的能量（一定波長）的輻射。譜線的頻率（）或波長（）與躍遷前后兩個能級的能量差之間的關系服從馬克斯·普朗克條件，即：
物質呈現特定顏色的原因是它們選擇性地吸收了可見光中特定波長的光線。物質只會選擇性地吸收那些能量等于分子振動、轉動和電子運動能量總和的輻射。由于物質分子的能級不同，它們對光的吸收程度也不同。因此，物質對光的選擇性吸收反映了其分子內部結構的差異，即不同物質的內部結構決定了它們對不同光線的吸收程度。因此，研究物質的吸收光譜可以提供關于其內部結構的重要信息。
朗伯-比耳定律
朗伯-比耳定律（Lambert-Beer），簡稱比耳定律，數學表達式為：
式中，為光程；為溶液的濃度；為吸光系數（單位：）。
式中，若將濃度用摩爾濃度表示，光程用厘米表示，則吸光系數為摩爾吸光系數（單位：），一般用表示。表達式可改寫為：
朗伯-比耳定律可以描述為：當一束平行的單色光通過某一均勻的有色溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的乘積成正比。朗伯-比耳定律是光度分析中定量分析的最基礎、最根本的依據。
工作原理
物質對光的吸收和物質的內部結構有關，通過對物質吸收光譜的測定、比較，可以進行定性或定量的分析。分光光度計通單色器分出不同波長的光作為入射光，使不同波長的光分別通過待測樣品，對每一波長的入射光透過樣品后可以測得吸收度。以波長為橫坐標，與波長相對應的吸收度為縱坐標作圖，就得到樣品的吸收曲線，也稱為吸收光譜。整個吸收光譜的形狀取決于樣品的性質、結構，所以可作為物質定性分析的根據。同時，只要選擇一定波長的光測定樣品的吸收度，由朗伯-比耳定律即可求出樣品的濃度和物質的含量。
基本結構
無論分光光度計的型號、類別怎樣，操作方式如何，是比較原始的手動儀器，還是自動化程度很高全部由微型計算機控制的最新式儀器，通常它們都由光源、單色器、樣品室、檢測器、顯示系統五個部分構成，其結構方框圖如下圖所示。
光源
光源即輻射源，是指能發射所需波長范圍的輻射的發光體。光源需要在廣泛的光譜范圍內提供連續的輻射光譜，覆蓋需要測量的整個光譜范圍，以便測量不同波長處的吸收光譜。光源需要具有足夠的輻射強度，以激發樣品中的分子從基態到激發態的躍遷，產生足夠的吸收光譜信號，以便能夠被檢測器檢測到。光源必須具有良好的穩定性，確保其輻射強度在一定時間內保持不變。這是為了確保測量結果的準確性和可重復性。光源的輻射能量在所需波長范圍內應該盡可能保持穩定，以減小因波長變化而引起的測量誤差。
用于分光光度計的光源有多種，常見的光源有：
單色器
單色器又稱為波長選擇器，能夠從輻射源輻射出的復合光中選擇分離出一定波長范圍的單色光，并能隨意改變波長。單色器將復合光分散成單色光，并通過調節色散元件的角度來選擇特定波長的單色光。單色器通常由以下五個主要部分組成：
樣品室及吸收池
樣品室是專供放置各種類型不同、光程不同、形狀各異的吸收池及相應的池架附件的小室。樣品室的內側面包括室蓋內表面都必須完全是黑色的，樣品室內的吸收池支架也應該是黑色的，室蓋必須十分嚴密且不漏光，以避免外部光線的干擾和不必要的反射。樣品室通常可拆卸，并配備不同類型的吸收池，以適應不同類型和尺寸的樣品。根據不同的應用需求，樣品室可以是普通型或大型型。大型樣品室通常用于測量固體樣品或在光學測量時直接測定樣品的透射和反射。
吸收池是用來盛放樣品的容器，確保樣品受到光的均勻照射，從而實現光譜分析。吸收池的材料必須在使用的波長范圍內不吸收光輻射，通常選擇光學玻璃、透明聚合物、高純二氧化硅、氟化鈣或氟化鋰等材料。吸收池的內部必須光潔無劃痕，平面度和平行度要符合規定范圍，以保證測量的準確性。在同一組實驗中所采用的吸收池需要有較好的配對性，以提高測量的精確度。常見的吸收池類型包括矩形池、圓型池、流動池、微型池、雙光路吸收池等。
檢測系統
檢測系統由檢測器和信號放大兩部分組成。檢測器是將化學或物理變化轉換為電信號的裝置，其質量直接影響到儀器的性能和測量結果的準確性。常用的檢測器類型有光電池、光電池、光電倍增管、光電二極管矩陣。
顯示系統
顯示系統又稱讀出系統，將檢測器輸出的電信號轉換為易于記錄和指示的物理量，以供操作人員使用。顯示系統對檢測器輸出的電信號進行處理，通常包括放大、濾波和數字化等過程，以確保信號質量的可靠性和準確性。將電信號轉換為易于記錄和指示的物理量，例如光吸收度、光強度或發光強度等，以便實現對樣品性質的定量或定性分析。
顯示系統配備了各種類型的顯示裝置，包括檢流計、微安表、數字電壓表、數字顯示表頭、打印機、計算機控制的記錄儀以及彩色或黑白圖像顯示儀等。簡易型儀器通常使用檢流計或微安表作為顯示裝置，適用于基本的光譜測量和定性分析。具有數字化功能的顯示表頭能夠直觀地顯示測量結果，并提供數字化輸出，方便記錄和數據處理。配備打印機的分光光度計能夠將測量結果直接輸出到紙張上，便于保存和報告。計算機控制的記錄儀能夠實現自動掃描功能，并通過計算機軟件實現數據處理和分析，提高測量的效率和精度。彩色或黑白圖像顯示儀能夠以圖形方式顯示測量結果，直觀地展示樣品的光譜特征，便于分析和比較。
分類
按工作波長范圍分類
可見光分光光度計
可見分光光度計是指使用光譜區屬于可見區的分光光度計，波長范圍在160~800 nm。這類儀器大部分是普及型、單光束方式、手控式的儀器，具有結構簡單、操作方便、價格低廉的優點。
紫外-可見分光光度計
紫外-可見分光光度計就其波長而言，通常是指200~800 nm或以此為主要光譜區的儀器，例如波長范圍為200~900, 200~1000或200~1100甚至200~1200nm也均屬于紫外可見分光光度計的范疇。
紫外-可見-近紅外分光光度計
紫外-可見-近紅外分光光度計是分光光度計中波長范圍最寬的一種儀器，波長范圍一般都在190~2600 nm或190~3500 nm之間，多為雙單色器和雙光束工作方式，儀器的光學系統和電路系統都比較復雜，屬高檔儀器，價格比較昂貴。
按光學系統分類
單光束分光光度計
單光束分光光度計是分光光度計中光路設計簡單的一種，只有一條光束，通過變換參比和樣品的位置，使其分別進入光路，再使參比進入光路時調零，然后將樣品移入光路就可在結果顯示器上顯示樣品的透射率及吸光度值。
雙光束分光光度計
雙光束分光光度計的光路設計基本上是與單光束相似的，差別只在單色器的出射狹縫和樣品之間加了一個斬波器。作用是以一定頻率把一個光束交替分成兩路，使一路通過參比孔，另一路通過樣品孔，然后由檢側器交替接收（或兩個匹配的檢測器分別接收）參比信號和樣品信號，接收的光信號轉變成電信號后，由前置放大器放大，并進一步解調、放大、補償等，最后由顯示系統顯示這兩種信號的比。
由于雙光束分光光度計采用雙光束方式，使測量程序大大簡化，既可以直接讀數，又可以掃描樣品吸收光譜，還可以增添很多附件，擴展使用范圍，排除由于光源強度不穩定而引入的誤差。
雙波長分光光度計
雙波長分光光度計主要用于測定混濁樣品。由混濁樣品的溶質顆粒造成的光散射使表視吸光度增加，甚至光譜產生畸變。雙波長測量不需要參比溶液，而是兩個單色器產生的單色光（一個在混濁樣品的峰值波長，另一個在谷值波長）由斬波器以一定頻率交替通過混濁樣品，然后由光電倍增管交替接收這兩個信號，并轉換成電信號。最后由峰值的吸光度誠去峰谷的吸光度，并在結果顯示器上顯示出樣品真實的吸光度。
使用方法
試樣制備
氣體試樣
對氣體試樣進行分光光度測定時，可以將氣體試樣直接注入氣體試樣池中。對易揮發的液態試樣也可用氣體試樣池。只要往氣體試樣池中滴入幾滴試樣，待其揮發成蒸氣并且充滿整個氣體試樣池后即可進行測定。
液體試樣
在制備溶液試樣時最重要的是溶劑的選擇問題。對分光光度分析用的溶劑的主要求當然是能使試樣充分溶解，在測定波長范圍內盡可能透明，含有盡可能少的干擾吸收峰，除此以外還應十分注意溶劑和溶質之間不能有明顯的相互作用，避免因產生“溶劑效應”而使比耳定律失效或造成試樣吸收峰變化。
固體試樣
對于那些無定形或粉末狀的固體試樣，如果不能找到合適的溶劑制備成溶液試樣，或者為了避免溶劑影響，或者為了研究固體狀態下的某些現象的本質，就必須保持試樣的固態形式即制備成固體試樣進行分光光度測定。制備固體試樣有兩類方法：設法獲得薄片或薄膜狀試樣；把粉末狀試樣分散到適當的介質中并賦以一定的形狀。
儀器預準備
每次使用儀器前，必須預先通電一段時間，使儀器的電子系統進入穩定工作狀態后才能進行測定(對電子管系統的儀器尤為重要，預熱時間應在半小時左右或更長些，否則會有明顯的測定結果漂移現象)。開機時應先開主機電源，后開光源電源。主機開機后應注意防止光電倍增管直接受到強光照射。
放入測定試樣前，應先仔細調零，檢查和調節基線的平直性，注意記錄器運動是否靈活正常，聽聽有否異常噪聲，掃描過程中光源、濾光片、光柵等關鍵零件有否運轉及切換不正常情況。確信一切正常后方可進行測定。
上機測樣
按照試樣測試要求確定工作波段、設定儀器掃描范圍。實測時，為了避免掃描機構中的機械空回、間隙等因素造成的波長誤差或其他隨機誤差，一般應從離待測吸收峰較遠的波長處啟動，然后單方向進行掃描記錄。
測試時應根據測定要求和試樣特性正確選擇儀器的工作參數，應特別注意狹縫寬度、掃描速度、響應速度、電子系統的增益等。狹縫寬度直接影響到測定時的光諧分辨率和儀器的測定靈敏度。若需高分辨率測定，則應使縫寬窄、增益高（但增益太高時噪聲也會相應增加）、掃描速度慢；反之，如不要求高分辨率測定，則可把狹縫開大些、掃描快些，以節省測定時間。
一般分光光度計的測量步驟可按如下進行：
注意事項
使用分光光度計時應注意保護儀器及其附件。各種操作鈕、開關只能輕緩旋轉或扳動，切忌碰撞或用勁硬擰。儀器中的各種精密光學零件工作表面、光源和接收器工作面都不能直接用手觸摸。在測試液體試樣或揮發性物質時應注意防止試樣及溶劑灑落在儀器上或殘留在試樣室中，以免腐蝕儀器。每次測試完畢，應使儀器返回掃描起始端、把各種操作鈕轉回安全位置（如電流最小、電壓最低、響應最慢、狹縫寬度最小等等）。如要安裝或換用不同附件，應先仔細閱讀儀器使用說明書，按照正確的方法和步驟拆卸或安裝。但要注意安裝基面及凸臺、銷釘、凹槽等定位、限位件位置是否正確，檢查附件中的光學零件表面是否沾污或有發毛、發烏、膜層脫落等現象。如發現問題必須及時處理或修復。
應用
科研領域
物質的鑒定
物質的吸收光譜與物質的屬性之間的對應關系是很嚴格的，有明顯的特征性。因此分光光度計可以根據每種物質在紫外-可見-紅外區的吸收光譜的特征譜線或譜帶，明確地判斷組成此物質的元素、化學鍵類別、包含的功能基團等，從而判認出該物質的類別，達到鑒定物質的目的。
結構分析
物質光譜中的吸收峰的位置和強度除了與組成此物質的分子、原子種類、數量和化學鍵有關外，而且也與其化學結構或立體結構有關，即與構成此物質分子的原子的空間排列幾何構型有關。因此兩種化合物即使其化學組成相同，只要它們的物質結構不同，它們的吸收光譜（主要是紅外吸收光譜）就不會一樣。因而，可以通過分光光度計來判識或確定物質結構、識別各種同分異構體(例如鏈異構、位異構、順反異構、多品異構等)。
純度檢驗
分光光度計可以鑒定化合物的純度，主要方法是對比已有化合物與純的化合物的吸收圖譜，如果產生特殊的吸收雜峰即可判斷化合物中含有雜質。
反應動力學研究
分光光度計通過吸收光譜的測定可以判斷反應過程的進程，從而得出一些化學反應速度常數，并從兩個及以上溫度條件下得到的速度數據，得出反應活化能。
絡合物組成及穩定常數的測定
絡合物是金屬離子與有機化合物進行配位產生的化合物，一般由中心原子和圍繞它的分子或者離子通過配位鍵形成，其在紫外可見區域具有一定的吸收性質。分光光度計通過對其進行紫外可見吸收的測定，可以推斷出該絡合物的組成成分及穩定常數。
對所測定的物質進行定量
通過準備不同濃度的標準樣品并在一定波長下測出吸光度值，結合公式，（為吸光度值；為吸光系數；為比色皿厚度；為溶液濃度）繪制吸收光譜曲線并擬合為線性方程，通過分光光度計測定未知濃度的樣品吸光度，代人方程可以得到該溶液濃度。
食品檢測
在進行食品的加工與制作的過程中，為了確保具有顏色的飲料產品保持相同的顏色，能夠在可見光區采用紫外可見分光光度計展開對其吸光度值的有效測定，令色差能夠達到食品生產的具體要求。
紫外可見分光光度計還能夠用于對食品的安全檢測。由于不同的物質具有不同的吸收光譜曲線，通過物質吸收光譜中特殊波長的峰值、波形變化，紫外可見分光光度計可以檢測食品中的物質含量。例如，可以運用紫外線分光光度法檢測食品中的復合型防腐劑、復合型鮮味劑等，較好地排除食品中不應當使用的添加劑。
環保監測
紫外可見分光光度計可以在將待測污染物樣品進行粉碎處理的前提下，滴入堿性提取液，采用浸出提取的方式，使浸出液中的Cr6+與酸性環境中的二苯碳酰二肼發生化學反應，產生紫色配位化合物，然后再在波長540nm處進行分光光度法測定，同時采用外標法進行數據定量分析，從而獲取精準的檢測數據和結果，使之成為環境監測保護的數據支撐。
對于廢水中的微量苯酚，可以用紫外可見分光光度計在苯酚的最大吸收峰為 269.3 nm 左右的波長下，測定不同濃度的苯酚標準樣品的吸光度，繪制相關曲線并計算苯酚在中性溶液中的表觀摩爾吸光系數為1524.58 L/摩爾，然后再通過定量測定的方式，測定并計算廢水中苯酚的吸光度，獲悉廢水中苯酚的濃度為39 mg/L。
在大氣污染監測中，主要的污染物包括二氧化硫、二氧化氮以及可吸入顆粒等，這些指標含量的多少會在一定程度上影響到區域空氣污染情況，所以上述指標就成為空氣污染監測重點。使用紫外可見分光光度計可以通過監測大氣中的臭氧含量的方式，觀察并監測數據，以此判定和分析大氣層的狀態，獲取大氣層是否被破壞的數據資料，為大氣污染處理和整治提供數據基礎。
造紙工業
紫外可見分光光度計可用于造紙工業中的單組份有色物的定量分析，多組分混合的分析以及紙漿中木質素的測定。生產過程中，蒸煮器的噴放線上可作蒸煮終點控制，漿料洗滌的最后階段可作洗滌效率測量，對漿料的卡伯價進行檢測來達到控制漿料質量和節約能量的目的。
醫藥領域
紅外分光光度計可以對藥物的規格進行檢驗。對于中藥材來說，由于其為天然產物，成分比較復雜，也可將其紅外光譜與已知中藥比對，鑒定中藥品質。為了控制藥品的質量，紅外光譜除用來鑒別藥物的主要成分外，有時也可用來驗證雜質成分是否為已知物并控制雜質的限度、或用于分析某些與藥物有關的物質。在藥物合成反應的過程中，通過對中間體的紅外光譜分析，能夠及時了解反應的情況，便于掌握反應下一步的順利進行。在生產藥物的進程中，一般會使同一批藥物的顏色相同，可以用紫外可見分光光度計測定其吸光光度值，符合相應的藥物標準，保證藥物質量合格。化學藥物中經常添加一些可使用的添加劑，降低成本和提高藥物效果，可以用紫外分光光度計檢測添加劑的質量并進行分析。根據不同特征基團在特定光波處的光譜特征，可以對含有氧核糖核酸或蛋白質等生物大分子的藥物進行檢測。
維護與保養
為了保證分光光度計具有良好的準確性可靠性和較長的使用壽命，必須使儀器處于良好的工作環境之中，同樣也必須經常地、仔細地對儀器加強維護與保養。
儀器的工作環境：應安放在室溫變化不大，不受陽光直射的房間內，并應放置在平穩的工作臺上。使環境的濕度保持在70%以下，并注意防塵、防震、防電磁干擾及防腐。
儀器使用者在使用儀器前應先詳細閱讀儀器的使用說明書，并了解儀器各鍵盤的作用與功能。
定期檢查儀器左部干燥筒內的防潮變色硅膠，如發現硅膠顏色變紅，應及時調換。
定期檢查儀器波長的準確性，以免引起不必要的測量誤差。
每次測量液體樣品后應檢查樣品溶液是否殘留在樣品室內，如有殘留液，則應及時擦干凈，以免污染樣品室。
儀器使用完畢后，用隨機提供的防塵套罩住，在套子內應放數袋硅膠，以免光源燈室受潮，影響儀器的性能。
參考資料 >
分光光度法的歷史.Lam Science.2024-04-12
Beckman Model DU Ultraviolet Spectrophotometer.Science History Institute.2024-04-13