反相色譜法所屬現(xiàn)代詞，指的是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質(zhì)及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關(guān)注。
簡介
反相液相色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質(zhì)及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關(guān)注．反相色語法是以表面非極性載體為固定相，面以比固定相極性強的溶劑為流動相的—種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、異內(nèi)醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大于300?的硅膠鍵合烷基固定相應(yīng)用較為普遍，聚合物基質(zhì)的反相色譜固定相也有較多應(yīng)用．
反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對于非極性化合物通常遵循以下規(guī)則：(弱)非鍵合硅膠<<基 反相條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于低PH、有機溶劑存在、溫度高于室溫和疏水鍵合相等綜合原因發(fā)生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨立或動態(tài)平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導(dǎo)致譜峰展寬、變形、甚至出現(xiàn)單一蛋白有多個峰的現(xiàn)象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脫蛋白的回收率低和鬼峰．反相色譜固定相表面基鏈長度對蛋白質(zhì)的反相保留和蛋白質(zhì)的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(C8、C22、C30)，固定相疏水性越強，為使蛋白質(zhì)等生物分子洗脫，流動相合機溶劑的含量較高，疏水性過強，會導(dǎo)致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分離中表現(xiàn)出優(yōu)勢。對多數(shù)小蛋白，在低pH乙/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開并避免聚集或沉淀，能夠得到理想的分離結(jié)果． 在低pH流動相條件下進行分離，如(0.1%TFA適合于大多數(shù)樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強的蛋白質(zhì)更有利；以乙腈作有機溶劑，丙醇可能對疏水性強的蛋白質(zhì)有利；柱溫50~80℃；將樣品溶于6mol/L尿素或鹽酸胍中(只可在室溫)進行預(yù)處理；用疏水性更強的鍵合相(長鏈與短鏈烷基鍵合相)；加兩性表面活件劑分離大分子和疏水性強的蛋白質(zhì)等實驗條件有利于蛋白質(zhì)樣品完全變性或盡可能降低變性。 參考資料 >